Teknik Hyphernated

Satyajit D. Sarker and Lutfun Nahar

Ringkasan

Teknik yang dikembangkan dari penggabungan teknik pemisahan dengan teknologi online pendeteksian menggunakan spektroskopi dikenal sebagai teknik hyphented. Kemajuan yang luar biasa pada metode hyphenated terjadi pada 2 dekade terakhir telah mengalami perluasan secara signifikan pada analisis dari biomaterial, khususnya produk natural. Pada bab ini, kemajuan terbaru dalam aplikasi dari beberapa teknik hyphenated, misalnya GC-MS, LC-PDA, LC-MS, LC-FTIR, LC-NMR, LC-NMR-MS dan GE-MS, dalam konteks analisis preisolasi dari ekstrak mentah atau fraksinasi dari beberapa sumber alam, isolasi dan deteksi online dari bahanalam, kajian kemotaksonomi, penelusuran kimia, kualiti control dari produk herbal, penggunaan replikasi dari bahan alam dan kajian metabolomikdidiskusikan dengan contoh yang sesuai. Penekanan khusus pada teknik hyphenated yaitu melibatkan kromatografi cair sebagai peralatan yang terpisah.

Kata kunci: teknik hyphenated, LC-MS, LC-NMR, LC-IR, LC-PDA, GE-MS, LC-NMR-MS, bahan alam

1.   Pengenalan

Beberapa dekade yang lalu, Hirschfeld memperkenalkan istilah hyphenated untuk menggantikan kombinasi yang terhubung dari teknik yang terpisah dengan satu atau lebih teknik deteksi spektroskopi. Teknik ini dikembangkan dari menggabungkan teknik pemisahan dan teknik pendeteksian spektroskopi yang sekarang dikenal sebagai teknik hyphenated (gambar 1).

Gambar 1 Teknik Hyphernated

Pada beberapa tahun belakangan ini, teknik hypernated mendapat perhatian yang meningkat sebagai prinsip untuk menyelesaikan masalah analisis yang kompleks.Kelebihan dari kombinasi teknologi pemisahan dengan teknik spektroskopi diperagakan selama beberapa tahun untuk analisis kuantitatif dan kualitatif dari komponen yang tidak diketahui dalam ekstrak alam yang kompleks atau fraksinasi. Untuk mendapatkan informasi struktural yangmengarah pada identifikasi senyawa yang terdapat dalam sampel mentah, kromatografi cair (LC), biasanya kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), kromatografi gas (GC) atau elektroforesis kapiler (CE) dihubungkan pada teknik deteksi spektroskopi, misalnya Fourier-transform inframerah (FT-IR), Fotodiode array (PDA) serapan UV-Vis atau emisi fluoresense, spektroskopi massa (MS) dan spektroskopi resonansi magnetic nuklir (NMR) menghasilkan beberapa teknik modern hyphernated misalnya CE-MS, GC-MS, LC-MS, dan LC-NMR.HPLC digunakan secara luas pada teknik analisis pemisahan untuk menentukan kuantitatif dan kualitatif senyawa pada ekstrak bahan alam.Koneksi fisik dari HPLC dan MS atau NMR meningkatkan kemampuan untuk menyelesaikan masalah struktural dari bahan alam yang kompleks.Karena sensitivitas yang lebih besar, LC-MS lebih banyak digunakan daripada LC-NMR.Hyphenated tidak selalu antara dua teknik, gabungan dari teknik pemisahan dan deteksi dapat melibatkan lebih dari satu teknik pemisahan atau deteksi misalnya LC-PDA-MS, LC-MS-MS, LC-NMR-MS, LC-PDA-NMR-MS dan yang seperti itu. Ketika analisis pelacakan penting, analit yang diperkaya sangat penting, gabungan secara online dengan ekstraksi fase padat (SPE), mikroekstraksi fase padat atau injeksi volume besar (LVI) dapat dimasukkan untuk membentuk sistem integrasi yang lebih kuat, misalnya SPE-LC-MS atau LVI-GC-MS. Dua elemen kunci dalam penelitian bahan alam adalah isolasi dan pemurnian dari senyawa yang terdapat dalam ekstrak mentah atau fraksinasi yang diperoleh beberapa sumber alam dan identifikasi yang tidak ambigu dari senyawa yang diisolasi. Demikian, ciri dari metabolit sekunder dari ekstrak bahan alam mentah atau fraksinasi menuntut kecanggihan yang tinggi dan  informasi struktural yang kaya, sensitivitas dan selektivitas. Perkembangan dari beberapa teknik hyphernated disediakan oleh peneliti bahan alam dengan peralatan baru dengan kekuatan ekstrim yang dapat menyediakan pemisahan efisien yang sempurna sebaik yang diperoleh dari komplementari online data spektroskopi pada puncak LC atau GC dalam campuran yang kompleks. Fokus utama dari bab ini adalah menyediakan rangkuman dari prinsip operasional dasar dari beberapa teknik hyphernated modern dan menyediakan beberapa contoh literatur dari aplikasi teknik ini. Informasi detail tentang prinsip, sejarah, instrumentasi dan metode tersedia dalam literatur.

2.  Teknik Hyphenated yang Tersedia

2.1GC-MS

Dengan MS sebagai metode deteksi yang lebih dipilih dan single- dan triplequadrupol, ion yang terjebak dan spektroskopi massa time-of-flight (TOF) sebagai instrument yang lebih sering digunakan, antara LC-MS dan GC-MS adalah teknik hyphernated yang paling popular digunakan sekarang.GC-MS, teknik hyphernated yang dikembangkan dari pasangan dari GC dan MS, yang pertama kali digunakan untuk penelitian dan tujuan pengembangan.Mass spektrum yang diperoleh melalui teknik hyphernated ini menawarkan informasi struktural yang didasarkan pada interpretasi dri fragmentasi. Fragmen ion dengan kelimpahan relatif yang berbeda dapat dibandingkan dengan spektra bibliotek.Senyawa tersebut adalah cukup menguap, kecil dan stabil pada suhu tinggi di kondisi  GCdapat lebih mudah dianalisis dengan GC-MS. Kadang-kadang,senyawa polar, khususnya yang sejumlah gugus hidroksil, perlu diturunkan untuk analisis GC-MS.  Teknik umum yang diturunkan adalah konversi dari analit ke derivate trimetilsililnya.Pada GC-MS, contoh diinjeksikan ke dalam tempat injeksi dari alat GC, diuapkan, dipisahkan dalam kolom GC, dianalisis dengan detector MS, dan direkam (gambar 2).

Gambar 2 GC-MS

Waktu yang dibutuhkan dari injeksi dan elusi disebut waktu retensi (tR).Peralatan yang digunakan untuk GC-MS umumnya terdiri atas tempat injeksi di salah satu ujung kolom logam ( sering dikemas dengan      bahan seperti pasir untuk meningkatkan pemisahan maksimum) dan sebuah detektor (MS) ujung lain dari kolom. Gas pembawa (argon, helium, nitrogen, hydrogen, beberapa nama) mendorong sampel turun ke kolom. GC memisahkan senyawadari campuran selama durasi dan detektor MS menyediakan informasi yang menambah identifikasi struktural dari masing-masing senyawa. Kolom GC-MS dapat dibagi menjadi 2 tipe: kolom kapiler dan kolom makrobor dan paket. Poin selanjutnya yang perlu dipertimbangkan secara hati-hati mengenai antarmuka GC-MS:

1.    Antarmuka memindahkan limbah secara efisien dari GC ke MS

2.   Analit tidak boleh mengalami kondensasi di antarmuka

3.   Analit tidak boleh terurai sebelum masuk dalam sumber ion MS

4.   Beban gas memasuki sumber ion harus dalam kapasitas pompa dari MS

Antarmuka yang paling banyak digunakan untuk GC-MS adalah model ionisasi tabrakan electron (EI) dan ionisasi kimia (CI). Bagaimanapun, dalam sistem modern GC-MS, beberapa tipe lain dapat digunakan yaitu memperbolehkan identifikasi dari molekul ion. Sebagai contoh, sebuah orthogonal TOF spektrometri massa dipasangkan dengan GC digunakan untuk memastikan kemurnian dan identifikasi dari senyawa dengan pengukuran tepat massa dan menghitung komposisi unsur. Saat ini, GC-MS digabungkan dengan beberapa database MS secara online untuk beberapa referensi senyawa dengan kemampuan mencari yang dapat digunakan untuk mengimbangi spektrum untuk identifikasi senyawa yang terpisah.

2.2         LC-PDA

Detektor spektroskopi sinar ultraviolet-tampak (UV-Vis) dipertimbangkan untukmenjadi detektor umum untuk sistim LC lainnya.Detektor PDA adalah bentuk detektor UV-Vis yang dipercepat, yang dapat dipasangkan ke HPLC untuk menyediakan teknik hyphernated HPLC-PDA, yang juga dikenal LC-PDA.Selama beberapa dekade terakhir, deteksi PDA online digunakan untuk analisis ekstrak bahan alam mentah dari bentuk asli.LC-PDA digunakan secara ekstrim untuk analisis bahan alam yang mengandung kromofor, misalnya senyawa fenolik meliputi flavonoid, isoflavonoid, kumarin, pterocarpan dan lain-lain.Detektor PDA dapat membantu menganalisis puncak LC tersendiri setelah selesai dioperasikan dan memperoleh spektrum UV-Vis yang lengkap dari masing-masing senyawa. Keseluruhan kromatogram pada beberapa panjang gelombang dapt diperoleh dari file data setelah analisis. Waktu retensi HPLC dan spektrum UV-Vis untuk senyawalain (puncak LC) dapat memiliki sifat yang khas dari senyawa spesifik. Detektor PDA juga memungkinkan generasi data 3D UV, biasanya terdiri dari spektra serapan UV dari 190-500 nm, untuk tiap poin bersama kromatogram HPLC.Data dapat ditunjukkan secara cepat untuk wilayah serapan yang unik dihubungkan dengan kelompok senyawa yang spesifik atau fungsional.Kromatogram sendiri dapat juga dibangun untuk tiap panjang gelombang untuk meningkatkan selektivitas dari data.Data UV dapat dilengkapi dengan data seleksi MS atau NMR.Pilihan fase gerak LC sangat penting untuk operasi LC-PDA dan dibuat berdasarkan titik potong UV yng ada di dalamnya, sehingga gangguan dari fase gerak dapat dihindari.Sistem modern LC-PDA dijalankan dengan software canggih yang memungkinkan dibentuknya pustaka spectral untuk referensi senyawa dan pencarian senyawa secara otomatis.

2.3         LC-IR

Teknik hyphernated berkembang dari rangkaian LC dan metode deteksi spektrometri infra merah (IR) atau FT-IR yang dikenal sebagai LC-IR atau HPLC-IR. Selama HPLC merupakan salah satu teknik pemisahan kuat yang tersedia pada masa ini, IR atau FT-IR merupakan teknik spektroskopi yang digunakan untuk identifikasi dari senyawaorganik, karena dalam wilayah IR menengah struktur dari senyawa organik memiliki pita serapan yang memiliki ciri fungsional yang khusus, misalnya –OH, -COOH dll. Bagaimanapun, kombinasi dari HPLC dan IR sulit dan kemajuan dalam teknik hyphernated sangat lambat, karena pita serapan dari pelarut fase gerak sangat besar dalam wilayah IR menengah sehingga mereka kadang mengaburkan sinyal kecil yang dihasilkan oleh komponen sampel.Sebagai tambahan, sebagai teknik deteksi, IR kurang sensitive dibandingkan dengan beberapa pendeteksi yang lain, misalnya UV dan MS. Perkembangan terbaru dalam teknologi HPLC-IR dengan memasukkan dua pendekatan dasar pada antarmuka yang diaplikasikan pada HPLC-IR atau HPLC-FTIR.Salah satunya yaitu pendekatan aliran sel dan lainnya adalah pendekatan eliminasi pelarut. Pendekatan yang digunakan dengan aliran sel pada LC-IR sama dengan yang digunakan pada UV-Vis dan detektor HPLC tipe lainnya. Pada kasus ini, serapan dari fase gerak menginduksi antarmuka dari deteksi pita serapan senyawa sampel, tetapi beberapa daerah transparan yang mungkin dihasilkan pada wilayah IR menengah.Sebagai contoh, jika digunakan fase gerak dari pelarut deuterasi misalnya air keras atau methanol perdeuterasi, IR dapat mengamati banyak senyawa organik yang memiliki struktur C-H pada molekul.Pendekatan eliminasi pelarut merupakan pilihan yang lebih disukai dalam pengoperasian LC-IR.Setelah pelarut fase gerak dihilangkan, deteksi IR dilaksanakan pada beberapa medium yang memiliki transparansi terhadap cahaya IR.Umumnya, garam KBr atau KCl digunakan untuk kumpulan senyawa sampel dalam eluen, dan pemanasan medium sebelum deteksi IR menghilangkan pelarut fase gerak yang mudah menguap. Ada dua tipe antarmuka untuk pendekatan eliminasi pelarut: pendekatan difusi-reflektans inframerah Fourier transform (DRIFT) dan teknik penyanggah memori. Penyatuan antarmuka untuk hyphernated GC, HPLC dan SFC pada penggunaan FTIR teknik mikrospik IR juga dimungkinkan sekarang.

2.4         LC-MS

LC-MS atau HPLC-MS merujuk pada gabungan dari LC dengan spektrometer massa (MS) (gambar 3). Sampel yang keluar terpisah dari kolom dapat diidentifikasi pada data spectral massa dasar. Pemilihan kran dapat membantu membuat kombinasi kerja dari dua teknik. Tipe otomatis sistem LC-MS terdiri atas diverter ganda 3-cara in-line dengan autosampel, sistem LC dan spektrometer massa. Diverter umumnya dioperasikan sebagai katup pemilih otomatis untuk mengalihkan bagian yang tidak diinginkan dari eluat pada sistem LC untuk dibersihkan sebelum sampel dimasukkan dalam MS. LC-MS menggabungkan kemampuan pemisahan kimia dari LC dengan kemampuan dari spektroskopi massa untuk menyeleksi temuan dan mengkonfirmasi identitas molecular. MS merupakan salah satu yang lebih sensitif dan metode  yang sangat selektif untuk analisis molekuler, dan menyediakan informasi pada berat molekul sebaik pola fragmentasi dari molekul analit. Informasi yang dihasilkan dari MS tidak berguna untuk memastikan identitas molekul analit.Analisis kualitatif membuat itu mungkin untuk merekonstruksi senyawa yang tidak diketahui dari data MS. Teknik ionisasi yang digunakan pada LC-MS umumnya teknik ionisasi lunak yang utamanya menampilkan spesies molekul ion dengan sedikit fragmen ion.Oleh karena itu, informasi yang dihasilkan dari pengoperasian LC-MS tunggal, struktur senyawa lebih kurang. Bagaimanapun, masalah ini sekarang dijalankan dengan pengenalan spektrometer massa tandem (MS-MS), yang menyediakan fragmen melalui pemisahan induksi tabrakan dari molekul ion yang dihasilkan. Penggunaan LC-MS-MS meningkat dengan cepat.teknik hyphernated seperti HPLC yang dipasangkan dengan UV dan spektrometer massa (LC-UV-MS) membuktikan lebih berguna dalam kombinasiskrining biological untuk survey cepat dari bahan alam. Sekarang ini, beberapa tipe sistem LC-MS memasukkan tipe antarmuka yang berbeda yang tersedia secara komersial.

Gambar 3 Skema sistem LC-MS (Antarmuka ionisasi electrospray)

Antarmuka yang didesain misalnya dengan menawarkan nebulisasi yang memadai dan penguapan cairan, ionisasi sampel, menghilangkan pelarut menguap yang berlebih, dan ekstraksi dari ion ke analyzer massa.Antarmuka yang paling banyak digunakan, khususnya yang berhubungan dengan analisis bahan alam, adalah electrospray (ESI) dan ionisasi kimia tekanan atmosfer (APCI).Yang kemudian dianggap sebagai kromatografer antarmuka LC-MS karena kemampuan laju aliran pelarut yang tinggi, sensitif, respon linear dan penggunan yang luas.Dengan antarmuka ini, beberapa tipe analyzer misalnya quadropol, penjebak ion atau TOF dapat digunakan. Masing-masing dari analyzer, bagaimanapun, menawarkan derajat yang berbeda dari keakuratan dan resolusi massa. Pada LC-UV-MS metode thermospray (LC-TSP-MS) dan antarmuka aliran continue FAB (LC-CF-FAB) dapat juga digunakan.Untuk analisis fotokimia, TSP dapat ditemukan sebagai antarmuka yang cocok karena memungkinkan pengenalan face cair ke dalam sistem MS pada laju aliran (1-2 mL/menit) cocok dengan yang biasa digunakan dalam analisis fitokimia.Pada penggunaan LC untuk LC-MS, pilihan yang lebih disukai adalah sistem fase terbalik menggunakan gradient atau pelarut isokratis campuran air, ACN atau MeOH.Jumlah kecil dari asam asetat, asam formiat, ammonium hidroksida/ larutan ammonia, atau ammonium asetat juga dapat digunakan sebagai fase gerak. Dalam hubungan dengan antarmuka ini, analyzer tipe yang berbeda, misalnya quadrupol, penjebak ion, atau waktu perjalanan dapat digunakan, dan mereka menawarkan derajat berbeda dari keakuratan massa dan kemungkinan MS-MS. Sistem LC-MS tidak memungkinkan identifikasi online yang lengkap dan tidak ambigu, kecuali bila merupakan bahan alam yang diketahui dengan baik, dan melengkapi informasi spektroskopik online jika tersedia di database. Salah satu masalah utama yang berhubungan dengan LC-MS adalah kualitas respon tergantung pada banyak factor misalnya komponen alam yang akan dianalisis, pelarut dan buffer yang digunakan sebagai fase gerak, laju aliran dan tentu saja tipe antarmuka yang yang digunakan. Untuk contoh, ekstrak bahan alam mentah umumnya mengandung sejumlah senyawa yang berbeda secara nyata dalam sifat fisikokimianya, kelarutan, ukuran molekul dan stabilitas. Oleh karena itu akan sangat sulit jika tidak mungkin mengoptimalkan kondisi ionisasi yang cocok untuk semua tipe komponen yang berbeda. Salah satu cara untuk mengatasi kesulitan ini adalah untuk menganalisi ekstrak dengan metode ionisasi yang berbeda.

2.5         LC-NMR

Di antara teknik spektroskopik yng tersedi sekarang, NMR mungkin yang paling kurang sensitif, dan itu belum menyediakan informasi struktural yang paling digunakan terhadap elusidasi struktur bahan alam.Pengembangan teknologi memungkinkan gabungan parallel dari sistem HPLC ke NMR, memberikan peningkatan ke teknik praktik baru HPLC-NMR atau LC-NMR, yang secara luas diketahui untuk lebih dari 15 tahun.Percobaan pertama HPLC-NMR online menggunakan superkonduksi magnet yang dilaporkan pada awal 1980an. Bagaimanapun, penggunaan dari teknik hyphernated ini dalam laboratorium analisis yang dimulai pada 1990.LC-NMR menjanjikan nilai paling besar dalam analisis campuran kompleks dari semua jenis, khususnya analisis bahan alam dan obat yang berkaitan dengan metabolit dalam biofluid. Percoban LC-NMR dapat menunjukkan antara metode aliran continue dan stop-aliran. Ruang lingkup yang luas dari masalah bioanalisis dapat menggunakan sistem 500, 600 dan 800 MHz dengan ­­₁H, ₁₃C, ₂H, ₁₉F dan ₃₁p probe. Prasyarat utama untuk LC-NMR online, sebagai tambahan pada instrument NMR dan HPLC, adalah probe aliran continue dan katup yang diinstal sebelum probe untuk merekam metode aliran continue lain atau aliran yang dihentikan. Spektra NMR. Detektor UV-Vis juga digunakan detektor utama untuk penggunaan LC. Penggunaan daya magnetic yang luas lebih besar dibandingkan 9,4 T direkomendasikan, misalnya frekuensi resonansi ₁H dari 400 MHz untuk pasangan HPLC-NMR standar. Analisis aliran sel awalnya dibentuk untuk perolehanNMR aliran continue. Bagaimanapun, diperlukan penunjuk struktural yang lengkap dari senyawa yang tidak diketahui, khususnya bahan alam yang unik, menghasilkan aplikasi dalam metode aliran yang dihentikan.Pada kenyataannya, keuntungan dari siklus tertutup pemisahan-identifikasi, bersama-sama dengan prospek dari penggunaan teknik NMR 2D dan 3D secara seluruhnya otomatis, menyebabkan perkembangan dari metode aliran yang dihentikan, misalnya metode pengurangan waktu.Sebuah perubahan tipikal dari LC-NMR ditunjukkan pada gambar 4.Umumnya, dalam sistem LC-NMR, unit LC terdiri atas autosampel, pompa LC, kolom dan detektor non-NMR (misalnya UV, DAD, EC, index refraktif atau radioaktivitas).Dari detektor ini aliran dirahkan ke dalam antarmuka LC-NMR, yang dilengkapi dengan penambahan siklus untuk penyimpana intermediate dri puncak LC yang dipilih. Aliran dari antarmuka LC-NMr kemudian diarahkan ke aliran sel NMR probe utama atau ke tempat penampungan limbah. Setelah perjalan menuju probeutama, aliran dikirim ke pengumpul fraksi untuk perbaikan dan selanjutnya pemeriksaan dari analisis beberapa fraksi dengan NMR.Spektrometer massa dapat juga diikutkan pada sistem melalui splitter pada output dari antarmuka LC-NMR. Pada banyak pengoperasionalan LC-NMR, kolom fase terbalik digunakan, menggunakan campuran pelarut binary atau tertiary dengan elusi isocratic atau gradient.Proton dari pelarut dari fase gerak menyebabkan beberapa masalah untuk memperoleh spektrum NMR yang cukup.Penerima dari spektrometer NMR tidak cukup mampu untuk mengatasi sinyal pelarut kuat dan sinyal bahan yang lemah pada waktu yang sama. Untuk mengatasi masalah ini, penekanan sinyal pelarut dapat dicapai dengan salah satu dari 3 metode utama : presaturasi, irradiasi banyak denyut lembut, atau peningkatan tekanan air melalui efek T₁ (WET) menggunakan presaturasi gradient z.masalah ini juga dapat diminimalkan dengan mempertimbangkan petunjuk berikut:

1.    Menggunakan eluen yang memiliki sedikit resonansi NMR ₁H yang mungkin misalnya H₂O , ACNatau MeOH

2.   Menggunakan sedikitnya 1 pelarut deuterasi misalnya D₂O (max $290/L), ACN-d3 (max $1600/L), or MeOD (max$3000/L).

3.   Menggunakan buffer yang memiliki sedikit kemungkinan resonansi NMR ₁H misalnya TFA atau aminium asetat

4.   Menggunakan pereaksi pasangan ion yang memiliki sedikit resonansi NMR ₁H yang mungkin misalnya pasangan ion dengan golongan t-butil mengakibatkan penambahan resonansi

Sampai saat ini, tiga jenis utama dari metode akuisisi data telah diperkenalkan: akusisi aliran continue,akuisisi aliran dihentikan dan akuisisi waktu dipersingkat.Apapun metode akuisisi, pengoptimalan pemisahan HPLC penting untuk analisis LC-NMR. Sensitivitas LC-NMR lebih kecil dibandingkan teknik hyphernated yang lain misalnya LC-MS atau LC-PDA, sangat penting untuk mengembangkan pemisahan LC yng cocok dimana kuantitas dari senyawa yang dapat dipisahkan dengan volume elusi terkecil.

Gambar 4 Sistem tipe LC-NMR

LC-NMR mewakili teknik pelengkap yang menarik  pada LC-UV-MS untuk analisis struktural online yang lengkap. Sesungguhnya, kemajuan terbaru dlam teknologi NMR memberikan dorongan pada LC-NMR yang penting sebagai penguat peralatan analisis.Perkembangan dari teknik penekanan pelarut efisien memungkinkan pengukuran dari spekta LC-₁H-NMR kualitas tinggi, antara mengalir dan berhenti mengalir, dengan kondisi HPLC fase terbalik.Pelarut tidak terdeuterasi misalnya MeOH atau MeCN dapat digunakan dimana air digantikan oleh D₂O.kemajuan terbaru dari hardware dan software untuk rangkaian langsungLC dan NMR memberikan kehidupan baru bagi teknik hyphenated. Perkembangan ini meliputi desain kumparan baru dan aliran sel untuk sensitivitas tinggi, sistim RF baru untuk penekanan banyak pelarut dan peningkatan kemampuan dinamis range gradient elusi dan kemampuan menyaring/menyimpan otomatis. Akibatnya, metode ini adalah peralatan yang kuat digunakan pada banyak bidang misalnya bahan alam, molekul orgnik, biomolekul, pencemar obat, pada hasil, campuran reksi dan produk degradasi obat.Kemampuan dari HPLC-NMR untuk menyelidiki dan menjelaskan struktur dari bahan alam baru memiliki perjalanan sangat panjang dari skema penekanan kekuatan pelarut, dan kombinasinya dengan seri homo dan heteromolekuler percobaan 2D NMR meliputi spektroskopi hubungan total 2D (TOCSY) atau spektroskopi perubahan nuclear Overhauser 2D (NOESY). LC-NMR, meskipun dikenal selama 2 dekade terakhir, tidak cukup menjadi teknik yang diterim secara luas, khususnya karena level sensitivitas yang rendah dan harga yang tinggi jika dibandingkan dengan teknik hyphernated yang lain. Bagaimanapun, keuntungan baru dalam teknologi, khususnya dalam hubungan dengan perkembangan pada gradient wilayah debaran dan metode penekanan pelarut,perbaikan dalam teknologi probe, dan pengenalan dari magnet wilayah tinggi (800-900 MHz)ditawarkan sebagai pendorong pada teknik ini.

2.6         CE-MS

CE merupakan teknik pemisahan yang diperkenalkan pada awal 1990an. Analisis CE dijalankan dengan medan elektrik,  ditunjukkan  dalam pipa yang sempit dan dapat menghasilkan pemisahan yang cepat dari ratusan komponen yang berbeda.  Kemampuan dan banyak metode yang dapat digunakan membuat CE dapat digunakan untuk memisahkan banyak molekul dengan metode yang kuat.Jenis pemisahan ini digunakan dengan kapiler tegangan penuh dan umumnya digunakan untuk memisahkan ion yang berpindah dengan kecepatan yang berbeda ketika tegangan yang diterapkan tergantung pada ukuran dan biaya.Solute ditunjukkan sebagai puncak ketika mereka melalui detektor dan area dari masing-masing puncak tergantung pada konsentrasinya yang memungkinkan menentukan kuantitasnya. Analisis meliputi penentuan kemurnian, uji dan penentuan kadar bahan. Ketika detektor MS dihubungkan dengan sistem CE untuk memperoleh data MS online dari komponen yang dipisahkan, menghasilkan kombinasi yang disebut CE-MS (gambar 5).Pemisahan dicapai melalui aliran yang digoreskan pada permukaan dari kapiler (dihubungkn pada sumber tegangan arus tinggi eksternal) yang mengantar sampel ke ESIMS.Teknik ini dijalankan secara otomatis dan menawarkan sensitivitas dan selektivitas yang tinggi. Tipe antarmuka baru, dikenal sebagai sarung koaksial antarmuka CE-MS cair, yang dikembangkan baru-baru ini, yang memungkinkan menggunakan alternatif LC-MS dan CE-MS pada spektrometer massa yang sama.sarung cair yang diperlukan disampaikan oleh pompa yang mengeluarkan semprotan ion pada MS, mencegah liran arus ke tanah. Metode LC-MS dapat dialihkan dalam beberapa menit.Untuk memperoleh semprotan ion yang stabil dan mencegah masalah elektrikal, sumber daya CE digunakan untuk menghasilkan potensial untuk pemisahan CE dan ujung penyemprot ESI secara serempak.Teknik pendeteksian ESIMS secara umum digunakan pada banyak sistem CE-MS karena ESI dianggap menjadi salah satu dari banyak peralatan online yang kuat untuk analisis biomolekul, meliputi bahan alam, menyediakan karakteristik berat molekul dan struktur dari analit.Pengoptimalan dari antarmuka CE dengan MS dapat menjadi perubahan yang nyata karena laju aliran rendah (10-100 mL/menit) dibutuhkan di CE, yang diterima oleh pembuat cairan.

Gambar 5: Sistem tipe CE-MS

2.7         LC-TLS

Baru-baru ini HPLC digabungkan dengan teknik deteksi spektrometri lensa thermal menghasilkan pengenalan LC-TLS. Metode ini menawarkan sensitivitas dan selektivitas yang cukup untuk proses studi fotokimia di fitoplankton lut yang melibatkan sejumlah jejak pigmen. Kajian lengkap, evaluasi metode HPLC-TLS dan pentingnya sebagai sebuah alat analisis, baru-baru ini diterbitkan.

2.8         Hyphenasi ganda

Parallel antarmuka dari sistem LC-NMR dengan spektrometer massa dengan perangkap ion (LC-NMR-MS) juga memberikan informasi struktural yang lengkap dan saling melengkapi. Identifikasi senyawa dalam campuran kompleks,seperti ekstrak bahan alam mentah melalui beberapa kromatografi hyphernated dengan range detektor spektroskopik seperti LC-PDANMR-MS, telah menjadi sarana yang berarti untuk memperoleh informasi yang pasti tentang struktur komponen yang ada dalam campuran (gambar 6)

Gambar 6 : Hyphernated Ganda

3.  Aplikasi Teknik Hyphenated dalam Analisi Produk Alam

Identifikasi dan karakterisasi yang sepat dari bahan alam yang diketahui dan baru secara langsung dari tanaman dan sumber laut tanpa harus diisolasi dan dimurnikan dapat dilakukan dengan beberapa teknik hyphernated modern (gambar 7). Teknik seperti HPLC dirangkai dengan NMR atau spektrometri tandem proses ionisasi electrospray (ESI-MS-MS) dibuktikan menjadi peralatan sangat kuat dalam analisis bahan alam, karena mereka memungkinkan skrining cepat dari ekstrak bahan alam mentah atau fraksi untuk informasi detail tentang profil metabolic, dengan sejumlah minimum material. Kombinasi aplikasi dari beberapa teknik hyphenated memungkinkan penemuan bahan alam baru, meliputi elusidasi struktur lengkap dan pasti, dan konfigurasi relatif yang silam terhadap waktu yang digunakanatau biaya proses isolasi dan pemurnian. Beberapa sampel dari penggunaan teknik hyphernated dalam analisis bahan alam didiskusikan disini.

Gambar 7: Kesimpulan informsi online yang dihasilkan dari teknik hyphernated

3.1Isolasi dan Analisi Produk Alam

Ekstrak bahan alam mentah, yang terdapat dalam campuran kompleks ekstrim dari beberapa senyawa, dapat berhasil dianalisis dengan teknik hyphernated yang sesuai.Di antara beberapa teknik hyphernated, LC-PDA dan LC-MS merupakan 2 yang paling luas digunakan untuk analisis bahan alam. LC-NMR,sebaik banyak teknik hyphernated yang berbeda, LC-PDA-NMR-MS juga menjadi popular saat ini.LC-MS, jika teknik ionisasi dipilih dengan tepat, dapat menjadi alat yang sangat kuat dn informative untuk skrining ekstrak tanaman mentah.Saat ini tersedia beberapa jenis sistem LC-MS yang memungkinkn analisis dari senyawa nonpolar kecil untuk bagian polar besar seprti oligosakarida, protein dan tannin yang terdapat dalam ekstrak bahan alam.

3.1.1   Alkaloid

Alkaloid adalah kelompok terbesar metabolit sekunder yang mengandung nitrogen dari tanaman, mikrob atau hewan.Beberapa teknik hyphernated digunakan dalam analisis beberapa tipe alkaloid saat ini.Dengan perkembangan dan kemampuan yang luas dari sistem yang terbaik, GC-MS menjadi metode yang dipilih untuk analisis beberapa tipe alkaloid pirolizidin dan quinolizidin.Alkaloid quinolizidin, kelas utama dari alkaloid yang ditemukan dalam fmili Leguminosae, dianalisis dengan GC-MS saat ini.Kebanyakan dari alkaloid ini cukup volatile dan termostabil di bawah kondisi GC untuk memungkin analisis tanpa modifikasi kimia.Akan tetapi, beberapa alkaloid hidroksi pyrolizidin harus dianalisis dalam bentuk derivate trimetilsilil.Alkaloid tipe epinefrin, dalam suplemen diet yang mengandung tanaman herbal Cina ma huang, dianalisis dengan GC-MS dan GC-FTIR. Sejumlah metabolit protoberberin, berbeda dalam jumlah dan tempat dari fungsi oksigen pada cincin aromatik, telah diidentifikasi sebelum diisolasi dari kultul sel Corydalis dengan LC-NMR dan LC-MS. Studi ini menyediakan petunjuk awal untuk jalur biosintesis untuk membentuk alkaloid, khususnya jalur metabolik untuk 2,3,10,11-oksigenat tetrahydroprotoberberin dalam kultur sel. Antarmuka APCI digunakan dalam sistem LC-MS dan spektra massa dihasilkan dengan monitor ion yang dipilih (SIM) dan monitor total ion (TIM) dalam mode ion positif. Informasi molecular ion dihsilkan pada dasar molekul ion proton [MþH]þatau gugus ion [MþHCF3]þ . Analisis LC-NMR digunakan pada varian peralatan spektrometer UNITY-INOVA-500NMR dengan PFG deteksi tidak langsung probe LC-NMR dengan 60 mL aliran sel, menggunakan metode aliran berhenti. Operasional LC ditunjukkan pada kolom fase terbalik Cosmosil 5 C18-AR (4.6_150 mm), menggunakan fase gerak yang disusun dari pelarut A ¼0.1MNH4OAc (0.05% TAF) dan pelarut B ¼ ACN. Aturan derajat elusi diadopsi mengikuti : 20-39% B dalam 10 menit, 30% B selama 10 menit dan 30-155% B dalam 10 menit, laju aliran 1 mL/menit, deteksi pada 280 nm.

3.1.2   Kumarin

Kumarin adalah kelas terbesar dari derivate 1-benzopyran yang umumnya ditemukan dalam tanaman tinggi.HPLC-PDA berhasil digunakan dalam analisis dari beberapa senyawa fenolik, meliputi kumarin, karena keberadaan dari sejumlah signifikan dari kromofor dalam molekul ini.Penentuan HPLC-PDA dari kumarin, dimana absorpsi spektra yang dicatat dengan detektor PDA, menyediakan informasi yang dibutuhkan tentang identitas dari molekul meliputi pola oksidasi.Waktu retensi dengan spektrum UV dari puncaknya dapat dianggap karakteristik, dan lebih mundah digunakan untuk mendeteksi kumarin yang diketahui dalam ekstrak mentah.Pasangan MS ke LC-PDA menyediakan informasi struktur yang membantu identifikasi online dari kumarin sendiri dalam ekstrak mentah. Beberapa kumarin bersama dengan senyawa oksigen heterosiklik lain, misalnya flavon psoralens dan polymetoksilat yang terdapat dalam sisa yang tidak menguap dari minyak esensial jeruk mandarin, jeruk manis, jeruk pahit, bergamot dan buah anggur, yang dianalisis dengan peralatan sistem LC-MS ionisasi tekanan atmosfer (API)dengan pro be APCI pada metode ion positif. Rekaman spektra MS pada tegangan berbeda menyedikan informasi berat molekul sebaik fragmen ion, dan ini memungkinkn identifikasi dari senyawa utama dalam ekstrak. Pada studi ini, minyak jeruk tekanan dingin dianalisis dengan sistim LC Shimadzu yang dirangkaikan dengan detektor UV dn MS dengan antarmuka APCI. Pemisahan LC dilakukan pada kolom C18 Pinnacle  (250_4.6 mm, 5 mm) , elusi secara isokratis atau menggunakan gradient pada laju liran 1mL/menit menggunakan campuran pelarut :  pelarut A (THF:ACN:MeOH: air  ¼15:5:22:58) dan pelarut B (100% ACN). Kumarin sebagai senyawa yang menyerap UV, dapat dideteksi pada 315 nm. Kondisi akuisisi MS mengikuti: probe tegangan tinggi, 4 kV; temperatur APCI 400 C; gas nebulizing (N₂) dengan laju aliran 2,5 L/menit; tegangan jalur kurva desolvasi (CDL) 25,5 V; temperatur CDL 230 C; tegangan deflector 25 dan 60 V dan metode akuisisi SCAN 50-500 m/z.

3.1.3  Karotenoid

Kelompok dari bahan alam ini meliputi hidrokrbon (karoten) dan derivate oxygenatnya (xanthophyll). LC-TLS berhasil digunakan pada penentuan karotenoid dalam 4 spesies fitoplankton laut dan pemisahan yang baik dari diadinoxhantin, diatoxantin dan karoten lain yang diperoleh melalui elusi isokratis HPLC dengan selektivitas dan sensitivitas yang lebih besar dari deteksi UV. Teknik ini memungkinkan monitoring terhadap perubahan dari diadinoxantin ke diatoxantin, dan perubahan dari karotenoid lain dibawah kondisi cahaya yang berbeda. LC-TLS juga ditemukan sebagai metode ultrasensitive untuk penentuan b-karoten dalam obat suplemen berbasis minyak ikan.

3.1.4  Ecdysteroid

Ecdysteroid adalah hormnon pada serangga dan kerng-kerangan untuk berganti kulit, dan juga terdapat dalam sejumlah famili tanaman. Kebanyakan memiliki 2b,3b,14a,20,22-pentahydroxy-5b-cholest-7-en-6-satu skeleton dengan hidroksilasi lebih lanjut. Beberapa teknik hyphernated, misalnya LC-PDA, LC-MS, CE-MS dan LC-NMR berhasil digunakan untuk identifikasi online dari ecdysteroid dalam ekstrak bahan alam mentah. Bru-baru ini, Louden dkk menjelaskan karakterisasi dan identifikasi spektroskopik dari ecdysteroid dalam Lychnis floscoculi (famili: Caryophyllaceae) menggunakan HPLC yang dipasangkan dengan banyak detektor PDA, FT-IR, NMR dan TOF MS. TOF MS dapat memastikan formula molekul dari senyawa yang dipisahkan melalui pengukuran akurat. Tiga ecdysteroid, ecdyson, 20-hidroksiecdison dan makisteron A, pada konsentrasi 10-20 mg/mL dari D₂O, digunakan sebagai senyawaacuan. Percobaan protocol yang dilakukan dapat dijelaskan sebagai berikut:

1.    Udara kering dan material tanaman dasar (L. floscoculi) diekstrksi dengan maserasi menggunakan EtOH dengan pengadukan terus selama 2-3 kali. Ekstrak disaring dan pelarut diuapkan.

2.   Larutan ekstrak dilrutkan kembali dalam MeOH dan disentrifus

3.   MeOH dari ekstrak jernih diuapkan sebelum digunakan pada HPLC dan dilarutkan kembali dalam sejumlah kecil D₂O

4.   Ekstrak (200mL) dianalisis dengan sistem HPLC Bruker fase terbalik (kolom analisis C18, dielusi secara isokratis dengan ACN:D₂O (99,8% murni isotopic ¼ 20:80, 1 mL/menit) dipasangkan dengan detektorPDA, FTIR, NMR dan MS. Senyawa acuan untuk elusi adalah 20-hidroksiecdison, makisteron A dan ecdison.

5.   Eluen mungkin akan menuju ke detektor PDA jenis 9065 pertama kali yang dapat mengumpulkan spektrum UV dengan panjang gelombang 190-360 nm, yang ideal untuk banyak ecdysteroid (lmax 238–242 nm).

6.   Keluar dari detektor PDA, eluen masuk ke dalam spektrometer FT-IR Bio-rad model 375C disetel dengan Spectra Tech Macro Circle Cell ATR (dilemahkan oleh total reflektansi) antikarat dengan laju aliran 400 mL volume. Spektrum IR diperoleh dengan software kinetic yang mengumpulkan 20 pemeriksaan tiap spektrum dan pada resolusi spectral 8 cm_1. Sampel dijalankan lagi dibelakang spektrum dari aliran pelarut sepanjang sel sebelum diinjeksikan larutan sampeluntuk mengurangi spektrum pelarut keluar dari spektrum sampel.

7.   Setelah FT-IR, eluen melewati detektor Bischoff Lambda 1000UV yang diatur pada 254 nm. Aliran pelarut kemudian dibagi 95:5 dengan 5% dari aliran langsung ke MS dan sisanya ke NMR

8.   Spektrum massa yang diperoleh pada spektrometer maassa Micromass  LCT TOF menggunakan ESI sengan sumber semprotan Z. aliran gas nebulizer diatur pada 85 L/jam dan gas desolvasi pada 973 L/jam. Spektum diperoleh pada metode þve ion dengan kapiler tenaga listrik 3,2 kV dan tegangan kerucut 25V. suhu sumber diatur pada 120⁰C dan temperatur desolvasi 350⁰C. range massa 100-900 Dalton

9.   Spektum NMR diperoleh menggunakan spektrometer NMR Bruker DRX 500 dlam mode aliran stop pada 500. 13 MHz dengan aliran probe 4 mm i.d denngan volume sel 120 mL. Spektra yang dibutuhkan digunakan tekanan NOESYPRESAT (tekanan ¼ 90, penundaan relaksasi ¼ 2 s, dan pencampuran waktu ¼ 100ms) mengurutkan untuk penekanan ACN dan sinyal residu air. FID dikumpulkan ke dalam 16K poin data di atas spektra 8278 Hz, menghasilkan waktu akuisisi 0,99 detik.

Spektrum UV (l_max 238-242 nm) diperoleh untuk masing-masing puncak pemisahan dri PDA dapat mengidentifikasi puncak pemisahan yang mungkin ecdisteroid, absorpsi IR sekitar 1645 cm_1 dapat diacukan pada gugus karbonil dari fungsi satu-en pada ecdisteroid, data NMR _­1H dapat dengan mudahmembedakan struktur antara ecdysteroid yang dipisahkan dibandingkan dengan senyawa acuan dan akhirnya MS dapat menyediakan informasi konklusif tentang massa molecular dari ecdysteroid yang dipisahkan. Oleh karena itu, dengan menggunakan banyak hyphernated digabungkan secara keseluruhan, seluruh pemisahan ecdysteroid dapat diidentifikasi dengan cepat hanya dari operasi tunggal.

3.1.5  Komponen minyak esensial dan menguap

GC-MS ditunjukkan menjadi alat analitikal yang berguna untuk analisis dri senyawa nonpolar utama dan bahan alam menguap, misalnya mono dan sesquiterpen.Chen dkk menjelaskan metode menggunakan penguapan langsung GC-MS untuk menentukan 130 komponen yang menguap dalam beberapa obat herbal Cina.Mereka melaporkan metode GC-MS efisien dengan EI untuk pemisahan dan penentuan struktur dari unsur dalam minyak menguap yang diekstraksi dengan eter dari obat mentah Cina, Jilin Gingseng, akar auklandie dan kulit buah jeruk tangerine.Senyawa, secara dominan monoterpen, dari minyak menguap dari oleoresin dari Pestacia atlantica jenis mutica, dianalisis dengan cept menggunakan GC-MS bersama dengan aplikasi database online.

3.1.6   Flavonoid dan Isoflavonoid

Flavonoid (2-fenilbenzopiran) merupakan kelompok terbesar dari bahan alam aktif secara biological, didistribusikan secara luas dalam tanaman tinggi, tetapi juga ditemukan dalam beberapa tanaman rendah, meliputi alga. Flavonoid bebas sederhana polar dan glikosidanya dengan jelas merupakan senyawa polar, dan dapat dipisahkan dengan efisienmenggunakan HPLC fase terbalik menggunakan kolom ODS C₁₈ dengn fase gerak MeOH atau ACN dalam beberapa perbandingan dengan elusi isokratis atau perbandingan. Senyawa ini UV aktif, teknik HPLCPDA digunkan secar luas untuk deteksi online dan deteksi parsial dari flavonoid dalam ekstrak tanaman. Perlusan dari teknik hyphernated memasukkan deteksi metode  MS dan NMR yang juga digunakan untuk analisis flavonoid. Untuk analisis LC-PDA-MS dri flavonoid, antarmuka ESI dan APCI ditemukan sebagai teknik yang popular karena mereka memungkinkan analisis dari flavonoid dari berat molekul dengan range yang luas, misalnya aglikon sederhana, glikosida  dengan beberapa ukuran dan malonat atau asetat tipe konjugasi. Akan tetapi, antarmuka lain, misalnya TSP, FAB dan API juga digunakan dalam jangkauan yang lebih sedikit. Untuk identifikasi tepat dari flavonoid sendiri dalam ekstrak mentah, sebih sering menggunakan LC-MS-MS atau LC-NMR-MS. Dalam model ESI, pada penambahan ion pseudomolekuler untuk flavonoid sendiri terdapat dalam ekstrak mentah atau fraksi, bentuk [MþH20]þ, [MþNa]þ, dan [MþMeOH]þ secara umum dalam analisis flavonoid. Flavonoid yang dipisahkan dapat diidentifikasi dengan membandingkan data UV-Vis dn MS dengan literatur data atau yangtersedia dalam beberapa database online. Selama penentun aktivitas antioksidan dari propolis dari beberapa asal geografikal, sejumlah flavonoid dipisahkan dan diidentifikasi secara kuantitatif dengan LC-PDA-MS. Ekstrak mentah mengandungpolifenol meliputi flavonoid yang dilrutkan dalam EtOH (5MG/mL) dan disaring dengan filter0,45 nm sebelum diinjeksikan 10 mL ke dalam sistem LC-PDA-MS. Kolom Capsel Pak ACR C₁₈ (2,0_250 nm, 5 nm) digunakan dan fase gerak yang tersusun dari 0,1% asam formiat dalam air (pelarut A) dan 0,08% asam formit dalam ACN (pelarut B). perbandingan 20-30% B selama 15 menit, 30%B selama 15-35 menit, dan 30-80% B selama 35-60 menit dengan llaju aliran 0,2 mL/menit. Analisis MS dilkukan pada spektrometer massa penjerap ion LCQ yang dilengkapi denganantarmuka ESI. Parameter operasi: sumber tegangan 5kV, tegangan kapiler ES 10V dan suhu kapiler 260 C. untuk mengidentifikasi masing-masing puncak, spektrum UV dan SIM dari spektrum MS dari semua puncak dibandingkan dengan sampel asli. Analisis kuantitatif dari masing-masing senyawa ditunjukkan dari kalibrasi kurva dari kromatogrm menggunakan senyawa asli, sama baiknya dengan intensitas ion dari spektrum MS. Isoflavonoid menjadi kelompok terbesar dari sekitar 700 senyawa yang berasal dari bahan alam, struktur dasarnya 3-fenilbenzopirn (3-fenilkromon). Seperti flavonoid, struktur dari isoflavon berbeda dalam derajat metilasi, hidroksilasi dan glikotransilasi.Identifikasi dari 14 konjugat isoflavon baru (8 isoflavonglikosida malonat dan 6 asetil glikosida) dlam Trifolium pretense (daun merah) ditunjukkan dengan LC-MS (antarmuka ESI) setelah 2D SPE. Spektrum UV, spektrum massa dari molecular ion yang terprotonisasi dan fragmen ionnyadan perubhan selanjutnya ke glikosida yang diketahui didasarkan dari proses identifikasi. Sistem HP 1100 LC digabungkan dengan detektor PDA dan HP MSD 1100. Spektrum UV direkam dalam range 190-400 nm karena absorpsi UV maksimal isoflavon banyak jatuh pada nilai ini. Pemisahan isoflavon dilakukan menggunakan kolom C₁₈ (2,0 150 mm, 3 mm), dielusi dengan gradient linear dari 15%-25% ACN dalam asam asetat encer (0,2% v/v) selama 36 menit, ditingkatkan hingga 55% ACN dalam 90 menit berikutnya pada lajualiran 0,3 mL/menit. ESI-MS direkam pada mode ion positif (temperatur gas 300 C, aliran gas kering 10,0 L/menit, gas nebulizer 40 psi, tegangan kapiler 3,5 kV, scan 100-800 m/z dan fragmentor 70-100 V). isoflavon dan konjugatnyadiidentifikasi dengan membandingkan waktu retensinya, l_max, dan ion [MþH]þ dengan rujukan senyawa isolate dan identifikasi sebelumnya.

3.1.7  Iridoid dan Secoiridoid

Iridoid adalah siklopentana-(c)-piran monoterpenoid dan glikosidany dan membentuk kelompok besar metabolit sekunder yang ditemukan dalam beberapa famili tanaman.Secoiridoid juga merupakan glikosida monoterpen yang berasal dari tanaman tetapi berasal dari precursor biosintesis, secologanin.Karena kurangnya kromofor penting dalam iridoid dan secoiridoid, kecuali derivate asilat aromatiknya, penggunaan HPLC-PDA terbatas dalam analisis senyawa ini.Dalam banyak analisis iridoid dan secoiridoid, LC-MS merupakan pilihan yang lebih disukai.Akan tetapi, pilihan yang lebih mahal misalnya LC-NMR, LC-MS-NMR juga digunakan untuk senyawa ini.Dalam analisis LC-MS, antarmuka TSP, APCI dan ESI sering digunakan. Sejumlah glikosida secoiridoid diidentifikasi dari Gentiana rhodantha dan Lisianthius seemannii dengan penggunaan LC-MS dengan antarmuka TSP. Informasi waktu retensi dan spektrum massa dibandingkan dengan sampel yang asli. Akan tetapi, identifikasi 3 secoiridoid kecil meliputi sweroside, perlu ditunjukkan dengan analisis LC-MS kedua menggunakan antarmuka FAB.Kombinasi teknik dari CE-MS dan HPLC-MS digunakan untuk menentukan glikosida iridoid dalam Picrorhiza kurroa. Dalam metode CE-MS (menggunakan tegangan 25 kV dan suhu pengatursuhu 30 C) memungkinkan mendapat pemisahan dasar dalam 16 menit menggunakan silica kapiler yang dilebur dan larutan buffer borat (100 mM, pH 8,6) mengandung 30mM SDS dan 1 % ACN. Dalam model HPLC-MS, antarmuka ESI digunakan, dan dominan ion [MþH]þ diperoleh untuk puncak glikosida iridoid. Hubungan yang baik antara profil glikosida iridoid dihasilkan dari observasi CE-MS dan LC-MS.

3.1.8  Saponin

Saponin adalah glikosida steroidal atau triterpenoidal yang terdapat secara luas dalam spesies tanaman sekitar 100 famili. Saponin sebagai senyawa sangat polar dan susah menguap, penggunaan GC-MS umumnya dibatasi pada analisis aglikon, yang diketahui sebagai sapogenin atau saponin. Terlepas dari beberapa saponin tidak memiliki kromofor yang penting untuk deteksi UV. Karena kurangnya kromofor pada saponin,teknik deteksi umum menggunakan UV atau PDA tidak membantu. Teknik deteksi altenatif misalnya index refraktif dapat digunakan.Kadang-kadang, derivatisasi saponin sebelum dikolom dapat digunakan mengikatkan kromofor yang memfasilitasi deteksi UV pada panjang gelombang yang tinggi.Di antara teknik hyphernated, LC-MS, LC-NMR dan CE-MS dapat digunakan untuk skrining awal dengan cepat dari ekstrak mentah atau fraksi yang ada saponinnya.Ketika dalam analisis LC-MS menggunakan antarmuka TSP dalam analisis fitokimia, saponin memiliki lebih dari tiga gula yang tidak dapat dianalisis menggunakan antarmuka ini.Untuk saponin yang lebih besar (MW >800), dipilih metode CF-FAB atau ES. Kombinasi dari kerangka ekstraksi disperse fase padat dan LC-NMR-MS digunakkan dalam identifikasi cepat dari asterosaponin dari bintang laut Asterias rubens. LC-NMR-MS menyediakan informasi struktural dalam penggunaan 1 kromatografik tunggal, dan cocok untuk saponin dengan berat molekul 1200-1400 amu. Teknik ini juga memungkinkan pengukuran LC-NMR semikuantitatif melalui sinyal metil  (Me-18 dan Me-19) dari skeleton steroidal.

3.2         Dereplikasi

Penggunaan beberpa teknik hyphernated dalam dereplikasi dan jejak kimia dari ekstrak bahan alam didiskusikansecara detail pada bab 12. Perbedaan antara uji sebelumnya atau penemuan ekstrak bahan alam dn isolasi senyawa tunggal ditemukan penting untuk mengurangi biaya dengan mengurangi kumpulan isolate yang besar yang kemudian dievaluasi secara detail. Panduan bioassay isolasi bahan alam sering digunakan terbatas untuk mengetahui senyawa atau non kimia atau kepentingan farmakologikal. Oleh karena itu, metode yang sesuai dapat membedakan tahapan awal dibandingkan senyawa alam yang diisolasi penting untuk penelitian bahan alam yang modern , murah dan efektif. Strategi dereplikasi memungkinkan kombinasi ilmu pemisahan, teknologi deteksi spektroskopik misalnya PDA, MS dan NMR, memungkinkan skrining ekstrak mentah atau hasil fraksinasi tidak hanya untuk aktivitas biological tetapi juga struktur.Untuk menunjukkan skrining efisien dari ekstrak, antara ujibiologikal dan analisis HPLC dengan beberapa metode deteksi yang digunakan. Teknik seperti HPLC digabung dengan deteksi fotodioda serapan UV (LC-DAD-UV) dan dengan spektrometri massa (LC-MS atau LC-MS-MS) menyediakan data analitikal dalam jumlah dari bahan ekstrak sebelum diisolasi. Kombinasi HPLC dan NMR(LC-NMR) mewakili daya yang dilengkapi dengan skrining LCUV-MS. Teknik hyphernated ini memungkinkan penentuan dengan cepat substansi dengan sejumlah kecil sumber material. Spektrum LC-MS-MS umumnya dihasilkan.Oleh karena itu, database MS-MS dari bahan alam dapat digunakan untuk tujuan dereplikasi.untuk tujuan dereplikasi otomatis online, Q-DIS/MARLIN_tm salah satu platform analitikl yang komprehensif dan kuat, yang idelny cocok untuk dereplikasi bahan alam. Identifikasi cept dimungkinkan pengelompokn kimia didasarkan pada data LC-MS. Q-DIS/MARLIN_tm juga sempurna untuk validasi otomatis yang disarankan untuk data kimia dari kombinasi percobaan kimia dari data LC-MS. Kebanyakan protocol dereplikasi untuk analisis bahan alam digunakan LC-PDA-MS. LC-NMR, walaupun dapat menyediakan informasi struktural yang berarti, kurang sensitif, kurang umum digunakan dalam instrument NMR dan harga yang dihubungkan dengan penggunaan pelarut deutersi. Akan tetapi, dengan pengenalan beberapa teknik penekanan pelarut, LC-NMR atau LC-PDA-MS-NMR perhatian  dri penelitian penelitian bahan alam.

3.3         Data Kimia dan kualiti Kontrol dari Obat Herbal

Penggunaan teknik hyphernated misalnya misalnya HPLC-PDA, LC-MS, CE-MS, LC-NMR atau LC-NMR-MS, dalam analisis data kimia untuk control kualitas dan standarisasi dari tanaman herbal.Umumnya, dalam konteks analisis obat, metode data digunakan untuk menarik profil dari matriks sampel yang sering cukup menyediakan indikasi dari penyiapan sumber dan metode. Dalam obat herbal, profil tergantung tidak hanya pada proses penyiapan tetapi juga kualitas dari sumber bahan mentah herbal. Kualitas dari tanaman yang sama dapat nyata tergantung pada daerah geografi, sumber, waktu panen dll. Keseragaman dan stabilitas dari profil kimia kemudian mewakili kualitas tanaman mentah.Praktek agrikultural yang baik (GAP) dan praktik pengolahan yang baik, analisis data digunakan menilai kualitas dari material tanaman. Dalam proses ini, objek fundamental dikembangkan antara penandaan senyawa dasar kromatografik atau profil spektroskopik dengan kemanjuran produk herbal. Kromatografi lapis tipis (TLC) merupakan metode klasik untuk analisis penelusuran jejak yang banyak digunakan dalam obat Cina. Dalam metode penelusuran data kimia, apapun mungkin, senyawa bioaktif atau senyawa penanda kimia penting diidentifikasi memungkinkan analisis konsisten dari bets ke bets. Sebagai contoh, pada analisis valerian (Valerina officinalis) dan penurun panas (Tanacetum parthenium), 2 senyawa penanda adalah asam valerenik dan asam asetoksivalerenik dalam kasus  pembentukan partenolid dan sesquiterpen lakton kemudian. GC-MS atau LC-MS digunakan untuk mendeteksi dan memastikan identitas dari data senyawa yang ditiru.Teknik ESI digunakan dalam dasar HPLCMS dalam penyelidikan kimia lengkap dari danshen, sanqi dan ginkgo. Dalam analisis pemeriksaan data, perlu untuk mengoptimalkan semua instrument dan metode untuk mencegah pembentukan artefak lain. Puncak intensif relatif penting dan hasil kromatografik harus spesifik untuk bahan yang dianalisis.Kemudian, penting untuk memeriksa kembali data yang dihasilkan dari produk botanical yang berhubungan dan mengetahui pemalsuan untuk menyakinkan bahwa metode yang dikembangkan dapat membedakan benar dari identifikasi yang salah.Beberapa protocol analitikal didasarkan pada data LC-MS yang dikembangkan dan digabungkan dengan program analisis tinggi dengan memasukkan metode standar, penentuan template struktur dan kepustakaan struktur. Sebagai contoh, LC-MS digunakan untuk karakterisasi campuran taxan dari ekstrak Taxus brevifoliadan mengembangkan database Taxan. Sensitivitas dari teknik hyphernated saat ini menyebabkan penyiapan sampel minimum, sehingga menghemat waktu analisis dan mengurangi degradasi tidak perlu dari senyawa.Sifat obat herbal yang digunakan dalam sistem tradisional misalnya obat tradisional Cina, atau Ayurveda, dianggap disebabkan karena keberadaan dari beberapa tipe molekul biologikal aktif.Variasi, antara kualitatif atau kuantitatif, dalam profil kimia dri tanaman dapat menyebabkan kehilangan sifat pengobatan secara keseluruhan, penurunan kemampuan, untuk tujuan control kualitas, memastikan keberadaan molekul spesifik dalam penyiapan herbal atau ekstrak, dan juga menentukan kuantitas dari masing-masing prinsil aktif dengan menggunakan metode yang sesuai, yang memungkinkan deteksi online dari molekul yang ada dalam ekstrak herbal. Kromatografi lapis tipis atau kromatografi kertas digunakan sebagai metode yang dipilih untuk control kualitas obat herbal jaman dulu. Sekarang, dengan adanya teknik hyphernated modern, memungkinkan memperoleh profilkimia akurat dari sediaan obat herbal atau ekstrak.GC-MS dan LC-MS digunakan secara luas untuk analisis langsung senyawa yang terdapat dalam sediaan herbal dan untuk meyakinkan kualitas dari herbal.Teknik ini digunakan dalam obat trdisional Cina. Spektrum massa dari beberapa komponen yang ada dalam ekstrak obat Cina diperoleh dari pengaplikasian LC-MS dan dipasangkan dengan standar yang diketahui untuk konfirmasi struktural. Penggabungan database MS juga berguna utnuk identifikasi dari senyawa ini. Pada metode ini, profil data GC-MS, LC-MS dan MS-MS dari bahan aktif ekstrak herbal Cina diperoleh, dan informsi disimpan dalam bentuk database elektronik, yang dapat digunakan untuk perbandingan rutin dari profil kimia dari ekstrak herbal sendiri untuk tujuan kontrol kualitas. Waktu retensi GC atau LC dan data spektrum massa dihasilkan, menyediakan kondisi kromatografik dan spektroskopik yang dijaga konstan. LC-NMR dan LC-NMR-MS juga digunakan untuk tujuan ini.Protokol sederhana untuk data kimia dari Ephedra menggunakan HPLC-PDA dijelaskan saat ini.  Ephedra sinica (famili : Ephedraceae), dikenal sebagai “ma huang” adalah salah satu tanaman obat tertua digunakan dalam obat tradisional Cina. Di barat, suplemen diet mengandung E. sinica dimunculkan sebagai salah satu penjualan tertinggi untuk penurunan berat badan dan menambah stamina digunakan oleh lebih dari 1 juta pengguna. Enam alkaloid efinefrin aktif (0,02-3,40% pada bagian antenna), (-)-efinefrin-(+)-pseudoefedrin,(-)-metilefinefrin,(+)-pseudoefedrin,(-)-norefinefrin dan (+)-norpseudoefinefrin diketahui sebagai bahan aktif dalam tanaman. Di antara itu, (-)-efinefrin sebagai bagian yang besar dalam E. sinica dipercaya sebagai senyawa aktif yang memberikan efek farmakologikal. (-)-efinefrin dan alkaloid lain juga dilaporkan menunjukkan efek samping. Oleh karena itu, keberadaan dan jumlah dari alkaloid ini, khususnya (-)-efinefrin, dalam E. sinica sangat penting untuk efek yang optimal dengan toksisitas rendah. Metode HPLC-PDA sederhana memasukkan pendekatan data kimia yang menunjukkan kegunaan yang lebih disbanding metode lain, misalnya teknik hyphernated kiral GC-MS, CE-MS, HPLC-PDA dan LC-MS, dijelaskan untuk kontrol kualitas dari Ephedra. Protokol keseluruhan data kimia dapat diringkas sebagai berikut:

1.    Semua spesies yang berbeda dari Ephedra digunakan (25 spesies)

2.   Material tanaman asal (maksimal 500 mg) ditempatkan dalam tabung Erlenmeyer Polypropilen Falcon Blue Max Jr. 15 mL dengan 6,0 mL aseton dan digojok selama 15 menit.

3.   Setelah digojok, sampel disentrifus selama 10 menit dan supernatant dipindahkan ke vial sampel

4.   Ekstraksi diulangi dua kali, supernatant yang dihasilkan digabung, dan pelarut (aseton) dihilangkan dengan rotavapor.

5.   Etanol absolut (5,0 mL) ditambahkan ke ekstrak kering dan ekstrak dibiarkan larut.

6.   Ekstrak dilarutkan 1 kali, 2,0 mL disaring (0,5 mL pertama dibuang) melalui filter Nylon 45 mm ke dalam vial HPLC untuk dianalisis.

7.   Analisis HPLC-PDA (sampel diinjeksi sebanyak ¼ 10 mL) dilakukan pada pemisahan penggabungan 2695 detektor PDA Water 996, menggunakan kolom water Xterra RP18 5mm (4,6 150mm) dan fase gerak, air isokratis:ACN ¼ 75:25 selama 10 menit, perbandingan air:ACN 1/475:25 75:25 pada ACN 100% selama 45 menit dan isokratis 100% ACN selama 10 menit, laju aliran ¼ 1 mL/menit. Kromatogram dideteksi pada 3 panjang gelombang yang berbeda, 210, 254 dan 320 nm dan dianalisis dengan perangkat lunak Water Millenium 32

8.   Waktu retensi dan spektrum UV yng dihasilkan untuk tiap puncak dipasangkan dengan standar alkaloid efinefrin yang diketahui. Penentuan kuantitas ditunjukkan pada area puncak yang diketahui alkaloid, utamanya efinefrin

9.   Metode data divalidasi dengan uji jumlah populasi dalam spesies tunggal Ephedra

Metode penelusuran data kimia dapat menguji kebenaran spesies Ephedra yang ada dalam bahan tanaman asal dan membedakan antara spesies Ephedra yang tumbuh di lokasi geografik yang berbeda.

3.4         Kemotaksonomi

Taksonomi kimia atau kemotaksonomi didasarkan pada prinsip keberadaan metabolit sekunder spesifik yang dipengaruhi oleh beberapa enzyme yang terlibat dalam biosintesis senyawa ini.Enzyme ini secara ketat dihubungkan dengan genetic yang membentuk orgnisme. Oleh karena itu, profilkimia dari metabolit sekunder, dengan isolasi dan identifikasi lengkap, atau dengan pemisahan dan identifikasi online menggunakan teknik hyphernated modern, dapat menyediakan informasi yang berguna dianggap hubungn taksonomi atau filogenetik di antara beragam spesies. Pengenalan teknik hyphernated dlampekerjaan kemotaksonomi dapat mengurangi waktu dan biaya secara nyata dengan pendeteksian dan identifikasi dari metabolit sekunder dalam ekstrak. Kite dkk menjelaskan pengaplikasian GC-MS dalam kemotaksonomi didasarkan pada profil alkaloid quinolizidin dalam kacang polong. Penggunaan GC-MS kemungkinan memperoleh data alkaloid quinolizidin kurang tersedia dengan menganalisis ekstrak mentah dari fragmen kecil dari specimen herbarium dan kemudian menyusun pengetahuan dasar yang ditemukan dalam distribusi komponen dalam beberapa jenis kacang polong.Dasar dari pola distribusi dari alkaloid quinolizidin, beberapa kesimpulan kemotaksonomi dapat dibuat.Sebagai contoh, dari analisis data GC-MS, diamati bahwa Poecilanthe mengndung alkaloid quinolozidin, dan secara khusus kombinasi dari struktur yang ada disarankan mirip dengan anggota Brongniartieae.Sebagai pemisahan HPLC yang diterima, penggunaan kolom C­₁₈ fase terbalik untuk mengelusi gradient ACN-air atau campuran MeOH-air dapat dicapai untuk flavonoid dan senyawa fenolik lainnya.LC-MS juga ditemukan berguna dalam studi kemotaksonomi didasarkan pada profil flavonoid dalam kacang polong. Sumber ES dan APCI dapat mengionisasi flavonoid dalam fasegerak ini, dan ionisasi diterima karena dicapai dalam mode positif ataupun negative pada daerah ion [M+H]^- dan [M+H]⁺ masing-masing. Teknik ini memungkinkan analisis dari beberapa ekstrak metanolik cair dari daun atau biji dari beberapa jenis kacang polong tnpa pemurnian lebih lanjut untuk memperoleh profil metabolomik flavonoid yang dihasilkan. Kombinsi LC-PDA dan TSP-LC-MS dipikasikan pada studi kemotaksonomi pada genus Epilobium (famili: Onagraceae), dimana flavonoid digunakan sebagai petunjuk kemotaksonomi karena kemotaksonomi didasarkan pada flavonoid lain yang diidentifikasi jenis yang morfologinya sama. Dengan mengaplikasikan LC-PDA dan teknik derivatisasi setelah kolom, mungkin untuk memperoleh informasi struktural yang dibutuhkan dari aglikon moiety dari glikosida flavonol dan hubungan pola hubungan pengganti. Lebih lanjut informasi struktur dari flavonoid yang dipisahkan diperoleh dari TSP-LC-MS. Antarmuka TSP cocok untuk merekam ion pseudomolekular lemah, [M+H]⁺ dan sinyal intensif yang berhubungan dengan fragmen aglikon [A+H]⁺. Pada beberapa kasus, mungkin juga untuk menyelidiki ion komplemen untuk moieties gula. Pengoperasionalan LC ditunjukkan pada HPLC Shimadzu dan kondisinya digunakanmengikuti: kolom waters NovaPak RP-18 (3,9 150mm, 4 mm) dilengkapi dengan prekolom NovaPak, dielusi dengan grdien ACN:water ¼ 0 menit 10% ACN, 4 menit 12% ACN, 12 menit 12% ACN,16 menit 18% ACN dan 30 menit 25% ACN menggunakan laju aliran 1 mL/menit. Untuk mencegah senyawa fenolik berekor, 0,05% TFA ditambahkan pada pelarut yang memberikan pH3,0. LC-NMR berhasil digunakan pada studi kemotaksonomi dari beberapa taksa Gentianaceae, didasarkan pada distribusi flavon, xanton dan secoiridoid, menggunakan kombinasi mode aliran jalan dan aliran mati.Pengaplikasian teknik hyphernated tidak perlu terbatas pada studi kemotaksonomi pada jenis tanaman saja.Teknik Frit-FAB-LC-PDA-MS digunakan dalam penyelidikan kemotaksonomi dari mikroorganisme yang didasarkan pada profil quinon isoprenoid. Pada studi ini, komposisi ubiquinone, menquinon, rhodoquinondan analognya ditentukan secara langsung dengan kombinasi informasi dari waktu retensi HPLC, spektrum UV dan spektrum massa tanpa sampel standar. Teknologi Frit-FAB dari LC-MS ditemukan lebih efektif untuk analisis produk mikrob yang labil dan tidak menguap. 15 stain mikroba, termasuk bakteri, actinomycetes, fungi dan ragi yang diketahui menghasilkan beberapa tipe isoprenoid quinine, dianalisis. Media pertumbuhn yang diperkaya, misalnya medium nutrient broth, marine broth, zoogloea atau ISP no.2digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme dengan protokol standar. Setelah pertumbuhan optimum,kultur sel mikroba disentrifus dan menghsilkan pellet dimana mengalami lypophilize dan menjadi serbuk kering. Sel itu kemudin diekstraksi dengan campuran kloroform (CHCl₃) dan MeOH (2:1 v/v, 100 mL/500mg sel kering) dan disaring dan pelarut dihilangkan dibawah vakum untuk menghasilkan ekstrak kering. Residu dilarutkan dalam aseton (100mL) sebelum diinjeksikn ke dalam sistem HP1190M HPLC-PDA-MS. Pemisahan dari isoprenoid quinon dalam ekstrak dilakukan menggunakan kolom Intersil ODS-2 (1.5_250 mm) dielusi isokratis dengan MeOH-isopropil alcohol (7:3 v/v) dengan laju aliran 0,11 mL/menit. Untuk campuran setelah kolom dari matriks dan dibagi rata, 6% larutan m-nitrobenzil alcohol dalam MeOH digunakan sebagai matriks dan dicampur dengan eluen HPLCpada 1mL/jam.Larutan dibagi dengan perbandingan 25:1.Analisis MS ditunjukkan pada spektrometer mssa JEOL JMS-SX 102 yang dilengkapi dengan sumber ion Frit-FAB dan senapan FAB.Xe digunakan sebagai penyanggah utama pada emisi 10mA yang terjadi.

3.5         Metabolomik

Metabolome menggantikan seluruh pelengkap dari metabolit dengan berat molekul rendah dalam sel biologikal dan juga digunakan untuk menjelaskanprofil kimi yang diperiksa atau data metabolit dalam seluruh jaringan.Metabolomik mewakili sejarah hidup dari organisme, meliputi umur dan factor lingkungan seperti tipe cemaran, kelembaban, suhu dan factor stress. Studi melibatkan analisis detail dari metabolom yang disebut metabolomik dimana merupakan wilayah baru yang muncul dalam penelitian bahan alam dalamera postgenom. Tujuan dari metabolomik, sebagai contoh, metabolomik tanaman, menyediakan penjelasan yang lebih baik dari metabolik atau fisiologikal fenotif lain melalui teknologi umum yang menghubungkan genom. Dalam metabolomik, profil metabolit tidak mempunyai target dan jaringan dari profil ke genotif atau transkrip yang dianggap isu kunci. Profil metabolit, tanpa isolasi metabolit individu, diharuskan melalui teknik analitik tinggi, misalnya beberapa tipe teknik hyphenated. Teknik hyphenated yang banyak digunakan dengan menganggap metabolomik adalah GC-MS, LC-MS, LC-PDA-MS, LC-NMR dan LC-NMR-MS. Contoh tipe dari studi metabolomik ditunjukkan dari profil metabolit, yang dicoba pertama kali pada pendekatan metabolomik antosianin kemotipe,dalam Perilla fructescens merah dan hijau menggunakan LC-PD-MS, CE untuk analisis anion dan LC untuk analisis asam amino. Tambahan, studi pada akumulasi antosianin sel khusus dan lokalisasi sintase antosianin dan ekspresi gen menggunakan pembeda mRNA menunjukkan 2 bentuk variasi kimia dari P. fructescensm, yang juga dilakukan. Protokol percobaan dihubungkan dengan dasar teknik hyphenated mengikuti:

1.    Bentuk merah dan hiju dari P. fructescen ditumbuhkan pada batuan wol dengan larutan nutrisi Hyponex (5-10-5) pada ruang pertumbuhan tanaman selama 16 minggu dengan periode cahaya 18 jam terang (4500 1x) dan 6 jam gelap pada suhu 25⁰C

2.   Daun dan batang dari bentuk merah dan hijau (max 1 g) diekstraksi dengan 6 mL campuran pelarut (MeOH:AcOH:air ¼ 9:1:10) tiap 1 g berat jaringan pada 4⁰C tengah malam

3.   Ekstrak disaring melalui filter Nylon 0,45 mm dan digunakan pada sistem HPLC-PDA-ESI-MS yang terdiri atas spektrometer Finigan LCQ DECA dan HPLC Agilent seri 1100

4.   Pemisahan LC dilakukan pada kolomODS-A312 (6,0 150mm) pada laju aliran 0,5 mL/menit menggunakan gradient lurus ACN:air:TFA ¼ 7,5:92,5:0,1 terhadap ACN:air:TFA ¼ 55:45:0,1 selama 60 menit

5.   Detektor PDA digunakan untuk mendeteksi serapan UV-Vis (200-700nm), ditrogen digunakan untuk ion +ve ESI-MS (temperatur kapiler dan tegangan 320⁰C dan 5,0 kV, masing-masing), lensa tabung dimatikandan diatur pada 10,0 V, spektrum massa penuh dihasilkan dari 80 sampai 2000 m/z pada 2 scan/detik dan analisis MS tandem ditunjukkan dengan litium sebagai penyebab tubrukan gas (normalnya energy tabrakan diatur hingga 30%)

Mengikuti protokol ini, 50 puncak yang dekat dipisahkan dan diidentifikasi dengan UV-Vis. Spektrum serapan dan fragmentasi MS dengan analisis Tandem MS dibandingkan dengan senyawa asli dan data yang dilaporkan sebelumnya. Jumlah dari pigmen antosianin, malonushisonin merupakan senyawa lebih besar (max 70%) yang dideteksi dalam daun merah. Akan tetapi,daun hijau ditemukan antosianin tidak terakumulasi atau hanya terakumulasi jumlah bekas antosianin. Pola metabolit yang sama diperiksa di batang dari 2 varietas P. fructescens. Dari hasil, disimpulkan bahwa kumpulan antosianin lebih spesifik pada bentuk merah, dan bentuk spesifik lebih tepatnya di daun daripada di batang. Jumlah flavonoid, luteolin dan apigenin terkonjugasi ada dalam dua bentukyang sama. Penemun ini mengindikasikan bahwa pengaturan produksi flavon berbeda dari produksi antosianin dalam 2 bentuk perilla.Jumlah asam osmarinic dalam daun hijau lebih banyak disbanding dalam daun merah, yang mungkin disebabkan oleh kompetisi untuk intermediate umum, 4-coumaroyl-CoA, antara biosintesis asam rosmarinik dan flavonoid.Profil dari anion misalnya nitrat, sulfat, fosfat, ditentukan dengan CE dan asam amino misalnya asam aspartate, treonin dan serin dengan sistem HPLC dengan derivatisasi post kolom untuk deteksi fluoresense. Antara profil itu sama antara bentuk hijau dan merah.Teknik hyphernated menjadi bagian sendiri dalam area metabolomik. Huhman dan Summer menggunakan pendekatan yng melibatkan pemisahan metabolom ke dalam beberapa subkelas diikuti analisis parallel menggunakan LC-MS. Saponintriterpen dari Medicgo sativa (alfalfa) dan akar M. truncatula dipisahkan, dibuat sketsa dn diidentifikasi menggunakan teknik hyphernated HPLC-PDA-ESI-MS

untuk gambar dan referensi selengkapnya silakan hub kxiehardi@gmail.com

atau pada akun facebook mardianti tandiarrang