Teknik Pemisahan & Isolasi Senyawa Organisme Laut

BAB I

PENDAHULUAN

Organisme laut merupakan organisme yang menghasilkan metabolit bioaktif sekunder yang bervariasi. Secara kimia, metabolit bioaktif ini dibagi menjadi asam amino, peptide, nukleosid, alkaloid, terpenoid, sterol, saponin, eter polisiklik dan lain sebagainya. Ekstrak etanol/methanol dari organisme laut memperlihatkan aktivitas biological dalam bentuk campuran dari beberapa kelompok komponen. Karena sifat kimia dari komponen bioaktif dari campuran kompleks tidak diketahui, bukanlah hal yang memungkinkan untuk selanjutnya dipisahkan komponen-komponen dari campuran kompleks. Bagaimanapun, pemisahan secara luas dari campuran dapat dicapai dengan fraksinasi menggunakan pelarut organik. Ekstrak etanol/methanol berhasil diekstraksi lagi dengan heksan, kloroform, etil asetat dan kemudian dibagi menjadi fraksi larut air dan tidak larut air. Masing-masing dari fraksi ini kemudian diuji untuk mengetahui aktivitas biologinya. Jika pemisahannya bagus, aktivitas biologi akan ditunjukkan oleh fraksi yang khusus. Kadang-kadang, aktivitas biologikal terdapat pada lebih dari satu fraksi.

Secara umum, komponen lipofilik terdapat pada fraksi yang larut heksan dan kloroform. Isolasi dari komponen murni dari fraksi larut heksan dan kloroform lebih mudah dibandingkan fraksi larut air. Komponen non polar yang diekstraksi di heksan, benzene, dan kloroform umumnya berupa ester, eter, hidrokarbon dari terpenoid, sterol, asam lemak dan sebagainya. Campuran ini kemudian dilarutkan kembali dengan teknik kromatografi standar dengan SiO2, Al2O3, HPLC dan sebagainya.

 

BAB II

PEMBAHASAN

II.1 Teknik Pemisahan

1. Komponen larut air

Ada beberapa masalah yang dihubungkan dengan pemisahan dari komponen larut air,yaitu:

a. Banyaknya garam yang terlarut dalam air laut ikut dalam ekstrak air sehingga pemisahan komponen larut air lebih membingungkan. Masalah ini diselesaikan dengan proses desalting atau penghilangan garam.

b. Pertumbuhan bakteri dan fungi, yang sering memperburuk komponen aktif atau memberikan hasil yang salah dari bioassay yang disebabkan oleh endotoksin yang dihasilkan oleh mikroorganisme.  Hal ini khususnya mengganggu dalam skrining aktivitas antitumorkarena banyaknya endotoksin, mis: lipopolisakarida (PS) yang menghambat aktivitas antitumor. Penambahan alcohol atau sejumlah kecil pelarut organik yang tidak bercampur, misalnya n-BuOH dan toluene dapat membantu mencegah pertumbuhan mikroba.

c. Aktifnya enzyme, misalnya glikosidase, sulfatase, proteinase dan beberapa oksidase pada proses menghomogenkan menyebabkan perubahan pada beberapa komponen bioaktif dan hilangnya aktifitas. Jika pemanasan tidak merusak aktifitas, pemanasan singkat atau autoklaf dapat mengurangi masalah yang ada. Contohnya mendidihkan organism sebelum diekstraksi digunakan pada kasus nereistoxin, insektisida dari cacing laut (nyale) dan glikoprotein dari kerang scallop.

d. Konsentrat dari ekstrak berair juga menghasilkan masalah yang disebabkan oleh pemanasan yang besar untuk menguapkan air. Proses penguapan yang diperlama sering menyebabkan rusaknya aktivitas. Masalah ini, bagaimanapun, dapat dihindari dengan pengeringan beku (freeze-drying).

Desalting (Penghilangan Garam)

Ketika bekerja dengan ekstrak berair dari organism laut, desalting mungkin merupakan proses yang paling penting dan sulit. Adanya garam inorganik dalam jumlah besar memberikan peningkatan hasil bioassay yang salah dan mengganggu pada semua pemisahan menggunakan kromatografi meliputi filtrasi gel. Metode yang umum digunakan dalam biokimia untuk menghilangkan garam tidak dapat diaplikasikan untuk isolasi komponen dengan berat molekul rendah dari ekstrak berair organisme laut. Jika ukuran ion organik dan komponen dengan BM rendah tidak berbeda, antara ion organik dan komponen yang diinginkan akan tampak pada posisi pada gel atau membran desalting yang umum digunakan dalam penyiapan biokimia.

Penghilangan garam dari residu/sisa pengeringan beku dari ekstrak berair organisme laut dapat dilakukan dengan mudah dan efektif menggunakan methanol absolute. Residu diekstraksi dengan methanol absolut dan pelarut dihilangkan. Proses ini diulangi 3-4 kali. Kemudian, sejumlah besar garam yang ada dihilangkan dan proses penghilangan garam ini menjadi lebih mudah. Bahan ini kemudian secara hati-hati disaring sepanjang gel dengan matrik kecil, misalnya Sephadex G-10 atau Bio-Gel P-2 untuk dihilangkan garamnya dan dipisahkan. Jika komponen yang diinginkan hidrofilik, penggunaan, salah 1 resin ionik misalnya XAD-2, XAD-7, serbuk polietilen atau polipropilen dan resin tipe polieter yang berpori dapat digunakan. Elusi dari molekul organik dipertahankan dan diperlambat oleh resin ini. Filtrasi sepanjang membran pori yang kecil biasanya memberikan pemisahan yang tidak sempurna dari garam.

Adsorpsi pada arang aktif juga efektif secara parsial untuk penghilangan garam. Umumnya, komponen bioaktif dari keseluruhan bagian organik larut air dan garam inorganik, merupakan fraksi yang sangat kecil. Ini menyebabkan proses untuk mengisolasi komponen aktif yang murni dari campuran kompleks sangat sulit. Tidak ada standar yang dittetapkan untuk prosedur fraksinasi untuk komponen larut air, yang sering digunakan adalah trial and error.

2. Kromatografi penukar ion

Kromatografi penukar ion merupakan metode yang paling efektif dari pemisahan komponen larut air jika karakter ionik dari komponen dan kestabilan pada resin dan dalam larutan penyangga diketahui. Pemilihan resin tergantung pada karakter ionik dan kestabilan dari komponen target pada resin. Yang harus diperhatikan adalah berapa banyak komponen yang terurai pada H⁺ dari resin asam kuat atau bentuk OH^- dari resin basa kuat. Begitupun, pH kuat dari larutan yang digunakan untuk elusi sering menyebabkan penguraian. Penggunaan resin asam atau basa lemah atau resin yang sedikit diberi buffer lebih dipilih dalam banyak kasus. Beberapa bentuk resin dengan keasaman atau sifat alkali yang sedang dapat digunakan.

3. Kolom fase terbalik (reverse-phase)

Komponen dengan range polaritas luas dapat dipisahkan dengan kolom fase terbalik dengan beberapa fase diam hidrofilik kombinasi yang sesuai dari pelarut organik, misalnya methanol, asetonitril, dan buffer, berhasil dilaporkan pada analisis biokimia dengan banyak tipe komponen. Beberapa masalah dijumpai ketika digunakan untuk tujuan preparatif, yaitu:

a.  Ukuran sampel yang terbatas. Sejumlah besar bahan yang diinjeksikan menyebabkan kolom yang mahal tidak dapat menampungnya. Untuk alasan ini, pemisahan pada kolom fase terbalik dilakukan pada proses pemurnian terakhir  atau pemisahan yang baik.

b.  Penggunaan larutan buffer. Untuk kebanyakan komponen polar atau ionik, untuk member efek yang baik pada pemisahan dan pemulihan, penggunaan buffer dengan pH yang sesuai dan kekuatan ionik sering tidak dapat dihindari. Pada beberapa kasus, pemisahan sejumlah kecil komponen dari buffer menjadi masalah yang besar. Ini dapat terjadi pada penggunaan buffer yang mudah menguap, yang dapat dihilangkan dengan penguapan vakum atau pengeringan beku. Harus diingat bahwa buffer yang mudah menguap juga digunakan pada kromatografi penukar ion biasa.

Buffer	pH
Ammonium acetate	7,8
Ammonium bicarbonate	5,7
Pyridine-HOAc	3,1
(16.1 : 278.5)
Pyridine-HOAc	5,0
(161.2 : 143.2)
Pyridine-HOAc-Picoline	8,0
(10 : 0.4 : 10)
Pyridine-HOAc-N-ethylmorpholine	9,3
(7.5 : 10.5 : 12.5)

Table 1 daftar sistem buffer yang mudah menguap

4. Kromatografi tekanan tinggi/sedang

Beberapa tipe baru dari fase diam yang telah dikembangkan ditemukan lebih efektif untuk tujuan preparatif dibandingkan kolom C₁₅ dan C₈ yang tradisional. Bahan ini memiliki matriks yang lebih berpori yang mempunyai kemampuan filtrasi molecular dan absorpsi dan tahan tekanan tinggi. TSK-125, TSK-250 dan TS-400 adalah contoh bahan yang diikat oleh silica dengan beberapa ukuran pori untuk pemisahan dari berbagai ukuran molekul. Bahan lain yang popular adalah matriks organik yang kaku, misalnya co-polimet styrene-divinylbenzene dengan sifat absorpsi dan karakteristik pori.misalnya TSK tipe gel H dengan perbedaan ukuran pori dan Gel Hitachi seri 3000

5. Kombinasi kromatografi penukar ion dan size-exclusion

Tambahan dari kemampuan penukar ion dari matriks dengan variasi ukuran pori menyediaan kemampuan pemisahan yang sangat kuat. Misalnya Sephadex DEAE, CMC dll. Pada banyak kasus, pemisahan didasarkan pada 3 prinsip : penukar ion, size-exclusionatau interaksi hidrofilik/hidrofobik. Oleh karena itu, pemilihan matriks yang tepat merupakan kunci agar pemisahan berhasil.

Komponen larut air	Pendukung
Mono- dan oligosakarida	Sephadex G-10, G-15, Bio-Gel P-2, resin penukar kation kuat (SO3H), resin penukar ion lemah, mis: -(CH2)NH2
Polisakarida	Sephadex G-50-200, Bio-Gel P-2, hydroxy appatite, DEAE bounded gels
Oligopeptida	Sephadex G-10, -15, Bio-Gel P-2, P-10, Sephadex LH-20, RP HPLC (C8, C18)
Amino, guinidino, asam amino	Resin penukar kation kuat (-SO3-), resin penukar kation lemah (-CO2H) RP HPLC (C8-C18 CN ) dll
Asam nukleat	Resin penukar anion, RP HPLC (C8, C18).
Asam karboksilat polar	Resin penukar ion kuat atau lemah RP HPLC (C18)
Glikosida	Sephadex G-10, LH-20, RP (C18, C8), XAD-2, XAD-7.

Table 2 pendukung kromatografi yang sering digunakan untuk memisahkan bahan larut air

Secara umum, komponen dengan sifat dasar dipisahkan pada resin penukar ion dan dengan kelompok asam fungsional pada resin penukar anion. Asam kuat atau resin dasar digunakan secara luas untuk memisahkan komponen netral dan amfoter. Metode fraksinasi klasik untuk komponen larut air disarankan oleh Shimizu. Kunci pada metode fraksinasi yang bagus digunakan oleh bioassay untuk mengontrol aktivitas dari semua fraksi yang dihasilkan, sehingga yang selanjutnya dilakukan hanya pada fraksi yang aktif dan seluruh pekerjaan kemudian langsung terhadap pemurniaan dari bahan aktif. Ini diperlukan ketika bahan aktif terdapat dalam jumlah kecil dalam ekstrak awal.misalnya kurang dari 1 mg dari bahan kering.

II.2 Bioassay yang Mengarahkan Fraksinasi

Pemilihan sistem pengujian untuk mengontrol fraksinasi didasarkan pada aktivitas asli dari ekstrak. Usaha dilakukan ketika memungkinkan menggunakan sistim in vitro lebih cepat dibanding tes in vivo dan juga biaya bioassay kurang. Misalnya, untuk aktivitas anti kanker, jalur sel  KB, L1210 (LE) dan P388 (9PS) digunakan untuk memantau kemajuan dari fraksinasi. Sistem PS in vivo digunakan hanya ketika ekstrak tidak aktif pada sistem in vitro.

II.3 Fraksinasi Umum

Ekstrak aktif pada tahap awal difraksinasi dengan partisi pelarut yang mengurangi sejumlah bahan tidak aktif, meskipun fraksi aktif dari partisi ini masih sangat kompleks. Fraksi secara umum, kemudian diperoleh, akan difraksinasi dengan kolom kromatografi oleh beberapa tipe(absorpsi pada silica gel atau alumina, penukar ion, partisi, permeasi gel) digunakan dengan variasi sistem pelarutyang diadaptaasi dari kepolaran fraksi aktif. Beberapa kromatografi diperlukan sebelum fraksi aktif dimurnikan. Teknik lain, misalnya TLC preparatif, HPLC, distribusi counter-current, elektroforesis dan kristalisasi fraksinasional, mungkin dibutuhkan pada fase akhir dari isolasi senyawa murni.  Proses ini akan rumit ketika sifat kimia dari bahan aktif tidak diketahui sehingga prosedur isolasi akan sulit pada beberapa kasus. Di samping itu, aktivitas dapat hilang dengan cepat ketika terjadi inaktivasi. Oleh Karen aitu dibutuhkan modifikasi dari prosedur isolasi agar aktivitasnya diperoleh maksimal dari 1 fraksi, dan bahan murni dapat diisolasi. Ketika terdapat beberapa senyawa aktif, akan sulit untuk dipisahkan sehingga sulit diisolasi.

Sifat Senyawa Aktif

Penjelasan struktur produk alami dengan aktivitas biologikal tinggi  antara menstimulasi dan menghambat. Langkah pertama dalam menjelaskan struktur yaitu memastikan bagaimana kerangka molekul, sering dipersempit dengan mengacu pada literature fitokimia yang dihubungkan dengan genus dan spesies. Pengetahuan biosintesis metabolit sekunder sangat membantu menyimpulkan pengganti yang paling masuk akal pada contoh dari kerangka dasar struktur nukleus yang dibutuhkan. Data spektra, misalnya ₁H NMR, ₁₃C NMR, IR, UV dan spectrum massa ditentukan dan dihubungkan dengan komponen yang dilaporkan yang mungkin dihubungkan dengan kimia dasar dan alas an biosintesis. Sayangnya, tidak semua senyawa yang diisolasi dengan fraksinasi activity-direct unik dan baru. Beberapa senyawa yang diketahui sering ditemukan. Metode klasik pengelompokan struktur membutuhkan degradasi molekul dan beberapa perubahan bentuk kombinasi  reaksi dengan analisis yang sulit dari data spektra derivatnya. Studi kristalografi sinar X akhirnya dilakukan baik pada senyawa itu ataupun atom berat yang mengandung derivatif untuk menetapkan struktur dan stereokimia.

II.4 Prosedur Isolasi

1. Asam amino dan peptide sederhana

Beberapa asam amino, amino sulfonik, asam iodoamino dan peptida sederhana telah diisolasi dari alga laut. Analisis asam amino alga dilakukan sama dengan tanaman bukan laut. Alga dihomogenkan dengan etanol 70%. Ekstrak yang mengandung nitrogen mengandung komponen meliputi asam amino, amida, peptida kecil, asam amino sulfonik, amine, klorofil, nukleotida BM rendah, garam inorganik, dan mirip protein. Umumnya berwarna pekat karena adanya klorofil dan karotinoid. Alcohol dari ekstrak etanol dihilangkan dibawah pengurangan tekanan. Konsentrat berair yang diperoleh kemudian dipartisi dengan eter. Komponen lipofilik larut dalam lapisan eter dibuang. Meskipun fase air dapat langsung diteliti untuk asam amino, dirasankan untuk melakukan pemeriksaan awal total asam amino fraksi dengan adsorpsi pada resin penukar ion asam kuat (mis: Dowex 50, bentuk H⁺ ) dan kemudian elusi dengan ammonia encer. Ammonia dihilangkan dengan pengurangan tekanan pada suhu rendah dan residu dianalisis denganmetode standar. Kromatografi kertas 2 dimensi (atau lapis tipis) digunakan secara luas. Analisis asam amino otomatis dan kromatografi gas memberikan jumlah akurat dari asam amino yang diketahui dan mudah mendeteksi senyawa baru. Ketika asam amino merupakan senyawa yang mudah menguap, kromatografi gas sebelumnya perlu diturunkan. Bagaimanapun, penambahan tahap ini tidak sulit dilakukan atau memakan waktu. Harus diingat bahwapenyiapan derivate umum dapat memodifikasi senyawa khusus dari campuran asam amino lain dibandingkan dengan melibatkan fungsi amino dan karboksil. Ketika trifluoro asetamida, n-butil ester digunakan sebagai derivate, senyawa glutamine dan asparagin diubah menjadi ester selama butilasion dengan butanol dan HCl kemudian menjadi tidak dapat dibedakan dari asam yang berhubungan. Selama proses derivatisasi yang sama metionin sulfoksida dikurangi menjadi metionin oleh HCl, dan kemungkinan sulfoksida menjadi reaksi analog. Namun,  kesulitan diatasi dengan melewatkan fraksi asam amino melalui kolom  dari Dowex-3 yang dicuci dengan air untuk menghilangkan asam amino netral dan  kemudian dielusi dengan 0,5 N asam formiat untuk memulihkan asam amino dan dikarboksilat sulfoxide metionin. Fraksi, yang diperoleh, kemudian individual diderivatisasi dan dianalisis dengan kromatografi gas. Metode yang paling fleksibel dan efisien untuk isolasi asam amino adalah kromatografi penukar ion. Banyak variasi metode telah digunakan dengan sukses. Umumnya, fraksi asam amino diserap ke resin pertukaran-kation asam kuat dalam bentuk H ⁺ ,yang kemudian dielusi dengan amonia encer atau gradien linier asam klorida. Pemisahan asam amino lebih mudah dilakukan pada kolom resin Dowex-1 dalam bentuk asetat; asam amino netral dan base dicuci dengan air, kemudian difraksinasi dengan gradien linier asam asetat. Asam amino base biasanya diisolasi oleh adsorpsi pada
resin penukar kation asam kuat (Dowex 50) dalam bentuk amonium dan
selanjutnya dielusi dengan ammonia encer (0,5 M) setelah dihilangkanasam amino netral dan asam dengan mencuci dengan air. Senyawa yang diisolasi dengan menggunakan salah satu metode ini sering membutuhkan pemurnian lebih lanjut. Hal ini dapat dicapai dengan teknik kromatografi lainnya (misalnya kromatografi kertas preparatif) atau dengan kristalisasi. Asam amino base biasanya dimurnikandengan garam yang tepat, di antaranya adalah flavianates, reinekat, dan oksalat.

Ekstrak alga, selain terdapat asam amino, juga senyawa nitrogen
yang tidak teradsorpsi pada resin penukar kation asam kuat.
Dari eluat dari kolom senyawa 'asam' (asam amino sulfonat)
dapat diperoleh kembali dengan adsorpsi, dan elusi dengan amonia 2N dari resin (Dowex-1), sedangkan "Netral" N-senyawa (misalnya N, N, Ntrimethyltaurine) tidak teradsorpsi pada resin asam atau dasar sehingga ditemukan dalam eluat akhir. Meskipun tidak ada metode umum yang telah dijelaskan dalam literatur, kolom kromatografi pada karbon-celite mungkin yang terbaik metode untuk memperoleh komponen individual dari campuran sulfonat amino asam. Metode lain yang efektif dapat kolom kromatografi pada selulosa bubuk, kromatografi kertas preparatif dan kromatografi lapis tipis pada silica.

2. Peptida

Haas dan Hill memprakarsai penyelidikan peptida dari ganggang laut.
Mereka mengisolasi suatu octapeptide dari asam glutamat dari ganggang coklat Pelvetina canaliculata. Sejak itu beberapa peptida sederhana telah diisolasi dari algae laut .Dalam beberapa tahun terakhir beberapa peptide penting telah diisolasi dari organisme laut. Discodermin-A, peptida bioaktif pertama diisolasi dari sponge laut. Discoderma kiiensis yang berisi asam tert-leusin dan cystein langka dan beberapa D-asam amino. Kemajuan pesat dalam kimia peptida spons terjadi karena perkembangan HPLC fase terbalik untuk isolasi peptide dan spektroskopi. Pada dasarnya 2D NMR dan spektrometri massa FAB untuk studi struktural, karena urutan analisis peptida yang tidak biasa tidak bisa dicapai oleh degradasi Edman karena adanya N termini diblokir dan β-dan γ-residu asam amino. 

Penetapan mutlak konfigurasi asam amino dengan sejumlah kecil dari material sekarang mungkin karena kemajuan dalam kromatografi kiral.Prosedur isolasi jumlah peptida yang tersedia dalam literatur.Sebagai contoh, jaspamide, dari Jaspis spp,. Cyclotheonamide-A dari laut spons, 13 onnamide-A dari Okinawan sponge genus Theonella spp. dan discodermin-A dari spons telah diisolasi. Peptida yang diisolasi dari sponge laut biasanya siklik dan lipofilik. Sangat mungkin bahwa linear atau lebih polar peptida telah terjawab sejak kimia yang menggunakan bioassay tertentu dalam isolasi peptida dari spons.

3. Nukleosid

Bergmann (1950) pertama kali mengisolasi tiga nukleosida yang tidak biasa, spongothymidine (Ara-T), spongouridine (Ara-U) dan spongosine dari spons laut Cryptotethia dengan ekstraksi Soxhlet crypta dengan acetone.Spongothymidine diperoleh dengan kristalisasi berulang campuran.Spongoadenosine dan 3'-O-asetil turunannya diperoleh dengan kromatografi pada silica gel kolom diikuti dengan silika gel preparatif TLC. Kromatografi pada Sephadex.LH-20 kolom diikuti dengan TLC preparatif dilengkapi adenosine dan deoxyadenosine. Kromatografi tentang Bio-Gel P-2 kolom diikuti dengan kromatografi pada SiO2 telah menghasilkan doridosine. The 5'-deoksi-5'- dimethylarsenyl-adenosin telah diisolasi oleh gel permeasi dan buffer kromatografi penukar ion dari ekstrak methanol berair . Adenosin dan 2'-deoxyadenosine adalah komponen yang umum asam nukleat, mungkin itu adalah laporan pertama dari kejadian mereka di bebas negara dalam spons. Hal ini tidak mungkin bahwa prosedur ringan isolasi yang telah digunakan akan membebaskan nukleosida ini dari bentuk-bentuk polimernya. Para
pyrrolo [2,3-d] pirimidin nukleosida mycalesine A dan B adalah mycalesine
diperoleh dengan ekstraksi laut spons Mycale spp.dengan etanol diikuti
oleh fraksinasi ekstrak dengan etil asetat dan selanjutnya SiO2 flash
kromatografi. Fraksi aktif menjadi sasaran kolom tekanan rendah
kromatografi pada Kiesel gel. Methylthioadenosine diisolasi dari
Doris nudibranch varrucosa dengan ekstraksi dengan aseton. Fraksinasi ekstrak aseton dengan eter dan n-butanol diikuti dengan kromatografi dari
fraksi aktif pada Sephadex LH-20 column.

4. Sitokinin

Sitokinin diketahui terlibat dalam pembelahan sel dan diferensiasi dalam tanaman. Secara komersial terdapat dalam bentuk ekstrak rumput laut digunakan untuk meningkatkan hasil di bidang pertanian, menunjukkan aktivitas sitokinin yang tinggi. Sitokinin dari organisme laut umumnya turunan purin diisolasi dengan kromatografi penukar ion preparatif dan dimurnikan dengan KLT silica HF-254 gel. Bintik-bintik yang divisualisasikan oleh paparan I2 uap / atau sinar UV. Sistem pelarut umumnya digunakan untuk TLC adalah: n-BuOH-HOAc-H2O (00:03:05), Zeatin, 1-methylzeatin, zeatin riboside , dihydrozeatin dan isopentinyl adenine telah diisolasi dengan mengikuti prosedur di atas dari laut alga hijau Caulerpa texifolia.

5. Alkaloid

Dari beberapa jenis alkaloid yang diisolasi dari organisme laut, lebih diperhatikan mengenai alkaloid pyridoacridine laut karena mempunyai aktivitas biologis yang signifikan terutama antiHIV, Pelepas Ca²⁺, memiliki sifat mengkhelat logam dan interkalasi dari DNA. Alkaloid Pyridoacridine biasanya diisolasi sebagai mikrokristalin refraktori padatan dengan titik leleh diatas 300 ° C. Dalam kebanyakan kasus, mereka telah diisolasi sebagai garam hidroklorida. Hanya sedikit yang optik aktif. Karena variabilitas di negara-negara oksidasi inti heterosiklik, ini menunjukkan alkaloid lancer reaksi redoks. Sebagai contoh, sistem iminoquinone hadir dalam banyak alkaloid mudah dikurangi dengan natrium borohidrida. Sebagian jenuh nitrogen cincin mengandung dalam alkaloid mudah diaromatisasi oleh oksidasi udara (Autoksidasi) pada penyimpanan atau pemanasan dalam larutan. Pyridoacridine alkaloid 2‑bromoleptoclinidone menunjukkan sifat toksik dalam kultur sel terhadap Pemisahan dan Teknik Isolasi  sel-sel leukemia limfositik (PS) diisolasi dari Leptoclinides ascidian spp. oleh Schmitz et al.27 Para olivaceum Eudistoma ascidian adalah luar biasa kaya sumber alkaloid berasal triptofan. Beberapa alkaloid bernama eudistomins memiliki sistem β-carboline telah terisolasi dari source. Eudistomin-A dan eudistomins lainnya menunjukkan aktivitas antivirus signifikan. Hexacyclic pyridoacridine alkaloid, segoline-A dan isosegoline-A terisolasi dari Eudistoma spp.

II.5 Toxin laut

Mayoritas racun laut yang diproduksi oleh mikroalga, terutama Dinoflagellata. Beberapa racun juga diproduksi oleh bakteri dan beberapa alga.

1.  Saxitoxin

Saxitoxin murni pertama kali diisolasi dari kerang mentega Alaska menggunakan basa lemah AMBERLITE IRC dan kromatografi alumina 50. Para Kerang mentega Alaska masih dianggap sumber terbaik saxitoxin. Para prosedur isolasi cukup sederhana. Namun,prosedur ini tidak berlaku
untuk isolasi racun kerang lainnya, karena ini adalah tidak kuat dasar. Sebuah prosedur umum yang sekarang umum digunakan,telah developed.
Campuran racun secara luas diselesaikan olehadsorpsi selektif tentang Bio Gel P‑2 atau Sephadex G 15. Fraksi toksin dielusi dengan asam asetat encer solusi. Campuran racun ini kemudian diterapkanpada kolom asam lemah karboksilat resin, Bio-Rex-70 dalam bentuk asam. Elusi gradien asam asetat memberikan racun murni dalam urutan terbalik dar imuatan positif bersih molekul. Namun, mereka tidak dapat dipisahkan dengan baik  kromatografi atau kromatografi lapisan tipis preparative, hati-hati tentang Bio-Gel P-2.

2.  Brevetoxins

Dinoflagellata Gymnodinium breve telah menghasilkan beberapa racun bernama brevetoxins. Kimia mereka sangat oksigen polieter. Dari terisolasi racun, brevetoxin-A adalah racun paling ampuh.Hal ini menarik tidak hanya karena adalah racun paling ampuh dari familinya tetapi juga karena unik mengikat natrium saluran membran bersemangat.Brevetoxin-B adalah anggota pertama kelas ini racun yang diisolasi dari sel-sel berbudaya Gymnodinium breve.34-37 budaya Unialgal G. breve terisolasi selama wabah di Florida ditumbuhkan dalam media air laut buatan. Media berisi sel diasamkan sampai pH 5,5 dan diekstraksi dengan dietil eter untuk memberikan 90mg dari brevetoxins mentah. Berulang flash kromatografi toksin mentah campuran dengan metanol 5% dalam eter diisopropil (v / v) memberikan brevetoxin A (0,8 mg) brevetoxin B (5 mg) dan brevetoxin C (0,4 mg). Kemurnian dari berbagai racun diperiksa oleh HPLC.34 brevetoxin-B dikristalkan dari asetonitril sebagai jarum tidak berwarna, m.p. 270 ° C (Desember); UV λmax (MeOH); 208 nm (ε 1600); FT IR (KBr, pelet) 1735 dan 1691 cm-1. 

3.  Tetrodotoxin

Tetrodotoxin adalah racun laut paling dikenal, karena seringnya
terlibat dalam keracunan makanan yang fatal, struktur kimia yang unik dan spesifik aksi pemblokiran saluran natrium membran bersemangat.
Tetrodotoxin adalah senyawa kristalin tak berwarna. Hal ini hampir tidak larut dalam semua pelarut tetapi larut dalam media asam dan basa lemah dalam medium. Para fitur luar biasa dari tetrodotoxin adalah bahwa jumlah oksigen dan nitrogen atom sama dengan jumlah atom karbon. Atom nitrogen tiga tetrodotoxin yang hadir dalam molekul sebagai bagian guanidin. Itu mengejutkan bahwa meskipun adanya fungsi guanidin dalam molekul, yang toksin hanya basa lemah (PKA 8,5) dan upaya untuk mempersiapkan kristal garam tidak berhasil. Namun, pengobatan dengan toksin 0,2 N HCl tidak menghasilkan, kristal O-metil-O, o'-isopropylidene-tetrodotoxin hidroklorida monohidrat. Sekitar 1-2 g tetrodotoxin kristal telah diperoleh dari 100 kg ovarium buntal oleh procedure.38 Hirata derivatif Tetrodotoxin terjadi di puffers, kadal, dan katak. Racun ini dapat dideteksi dengan sangat tetrodotoxin sensitif analisa yang memisahkan mereka pada fase terbalik kolom dan mendeteksi produk neon terbentuk pada saat pemanasan toksin dengan larutan natrium hidroksida.

4.  Ciguatoxin dan turunannya

Ciguatera merupakan keracunan makanan yang membahayakan kesehatan masyarakat dan menghambat perikanan lokal di daerah tropis dan subtropis di dunia, adalah disebabkan oleh ciguatoxin dan congeners nya.Ciguatoxin (0,35 mg) diisolasi dari visera dari belut mollay,  javanicus Gymnothorax (125 kg) Ciguatoxin pertama kali diisolasi pada tahun 1980 oleh kelompok Scheuer yang di University of Hawaii dan ditandai untuk menjadi komponen polieter . Ini struktur ciguatoxin akhirnya dijelaskan oleh kelompok Yasumoto di 1989, Congener Ciguatoxin telah diisolasi baik dari fish beracun atau dari G. berbudaya toxicus. Puluhan analogciguatoxin telah ditemukan di ikan dan di dinoflagellates. Namun, hanya beberapa dari mereka telah diidentifikasi.

5.  Maitotoxin

Maitotoxin (MTX) telah diisolasi dari sel-sel berbudaya Gambierdiscus
toxicus.Sekitar 25 mg maitotoxin diperoleh dari 5000 L budaya. Maitotoxin telah menarik banyak perhatian karena itu molekul formula C165H258Na2O67S2 dan berat molekul3421,6 Da (sebagai garam dinatrium), itu bioaktivitas sangat potensial.Yang mematikan terhadap tikus, LD50 adalah ca 50 ng / kg (ip) dan memainkan peran dalam diversifikasi Ciguatera gejala, terutama pada keracunan yang disebabkan oleh ikan hervivorous. Maitotoxin adalah polieter mengandung dua fungsi estersulfat, 32 cincin eter 29 kelompok metil hidroksil dan 21. Satu-setengah dari molekul maitotoxin, yang meliputi Sebuah fragmen, relatif hidrofilik, sementara separuh lainnya, terdiri dari sebagian  besar cincin menyatu kontinyu hidrofobik, sehingga akuntansi untuk polaritas duel toksin.

6.  Palytoxin dan turunannya

Palytoxin merupakan zat yang sangat beracun yang ditemukan awalnya dalam genus Palythora dari coelenterates laut. Mematikan intravena nya (LD50) adalah 0,025 mg / kg pada kelinci dan 0,45 mg / kg dalam mouse. Palytoxin dan congenersnya tidak hanya ditemukan di karang Palythora lembut tapi dalam berbagai macam organisme laut lainnya, seperti Armata Chondria rumput laut, kepiting milik ke Demaria genus dan Lophozozymus, sebuah triggerfish Melichthys vidua dan file-ikan Alutera scripta. Continuous bunga dalam racun Palythora spp. Menyebabkan isolasi empat racun ringan dicirikan sebagai homopalytoxin, bishomopalytoxin, neopalytoxin dan dideoxypalytoxin dari P. tuberculosa. Moore dan Scheuer adalah yang pertama untuk mengisolasi palytoxin dari T. toxica. Toksin sepenuhnya diekstraksi dengan 70% etanol-air dari unground yang basah hewan. Reverse-fase kromatografi dari ekstrak dihilangkan lemak pada bubuk polietilen dipisahkan toksin dari garam anorganik dan organik polar lainnya bahan. Elusi kolom dengan etanol berair 50% yang siap memberikan beracun fraksi. Berturut-turut pertukaran ion gel fitration bahan toksin pertama pada DEAE-Sephadex pada pH-7 dan kemudian pada CM pada pH 4,5-5 Sephadex, palytoxin murni menghasilkan di 0,027% hasil berdasarkan berat basah dari hewan. Prosedur yang sama digunakan oleh para peneliti Jepang untuk mengisolasi palytoxin dari P. tuberculosa. kromatografi fase-balik, bagaimanapun, dilakukan pada gel polistiren bukan bubuk polietilen. Pemisahan dari neopalytoxin dari palytoxin tidak layak oleh HPLC, tapi itu mungkin oleh HPTLC. Palytoxin adalah air, berwarna larut, amorf higroskopis padat. Upaya untuk mengkristal toksin dan turunannya tidak berhasil. Toksin itu [α] D + 26 ° dalam air.

7.  Gambierol

Gambierol, tangga berbentuk senyawa polieter, diisolasi dari
Gambierdiscus toxicus (RGI-regangan) berbudaya cells. Sel-sel berbudaya dinoflagellata itu diekstraksi dengan MeOH.Ekstrak dipartisi
antara CH2Cl2 dan MeOH/H2O (6:4). Toksin diekstrak ke
fase organik dan selanjutnya dimurnikan dengan bioassay mouse dipandu. L 1100 budaya dilengkapi 1,2 mg gambierol, sebagai padatan amorf. UV λmax (MeOH) 237 nm (ε 15.000). 

8.  Asam okadaic dan turunannya

Asam Okadaic dan derivatnya tidak bertanggung jawab atas diare paling manusiawi keracunan kerang (DSP) terkait penyakit. Asam pertama kali diisolasi dari yang okadai Halichondria spons, 52 dan kemudian ditemukan dinoflagellates Prorocentrum lima dan Dinophysis spp. Spons H. okadai diekstraksi dengan MeOH. Ekstrak metanol berulang kali
dikromatografikan pada gel polystryrene.Sephadex LH-20: SiO2, mengkristal dari MeOH dan rekristalisasi dari diklorometana / heksana dilengkapi okadaic asam, jarum sebagai berwarna, m.p. 171-175 ° C (10-4% yield); [α] D + 21° (C, 0,33, CHCl3); UV (penyerapan akhir) dan IR (3450, 1740, 1080, 880 cm-1).

9.  Toxin Lainnya

Penyaringan mikroalga untuk produksi toksinmenyebabkan isolasi lebar berbagai metabolit beracun dari dinoflagellata.Para dinoflagellata dibudidayakan Amphidinium spp. Telah melengkapi amphidinolides A, dan C. Amphidinol sebagai kuning pucat padat amorf: [α] D ‑ 250 ° (c, 0,18,MeOH); UV λmax (MeOH) 259 (37, 500), 270 (41, 900) dan 282 nm (27,500), telah diisolasi dari kultur sel dari dinoflagellata  Amphidium klebsii. Goniodomin‑A,  Novel makrolida polieter antijamur telah diperoleh dari dinoflagellata. Goniodoma pseudogoniaulax dengan kromatografi kolom pada gel silika diikuti oleh fasebalik HPLC. Neosurugatoxin (4 mg)diisolasi dari midgut kelenjar kulit gading Jepang Babilonia japanica(20 kg) sebagai penyebab agen keracunan akibat konsumsi gading beracunshell.Kelenjar midgut kerang itu diekstraksi dengan AcOH 1%. gel filtrasi pada kolom Sephadex 825 dan kemudian pada satu CM‑Sephadex kolom penukar ion dan akhirnya oleh HPLC fase terbalik menghasilkan neosurugatoxin. Itu ditemukan sangat tidak stabil dalam medium alkalin dan labil cukup panas. Sebuah beracun glikosida, bernama polycavernoside A, telah        diisolasi dari  alga merah Polycavernosa tsudi.  Alga  merah (2 kg) diekstraksi dengan aseton  Para bahan beracun dimurnikan dengan kromatografi kolom, dipandu oleh mouse bioassay.

Prosedur untuk isolasi sulfat fucan dari dinding tubuh laut Stichopus japonicus mentimun dan kemampuan mereka untuk menghambat osteoklastogenesis yang dijelaskan

BAB III

PENUTUP

Tidak ada teknik khusus yang dapat diikuti untuk pemisahan komponen dari campuran kompleks yang terdapat dalam ekstrak methanol/etanol dari organisme laut ketika sifat kimia dari senyawabioaktif tidak diketahui. Meskipun begitu, secara umum dengan fraksinasi menggunakan pelarut organik. Jika pemisahan efektif, aktifitas biologikal dapat diperoleh padakonsentrat tertentu. Terdapatnya garam yang melimpah dari air laut dapat ikut dapat ekstraksi sehingga pemisahan komponen larut airnya menjadi membingungkan. Konsentrasi ekstrak air juga menghasilkan masalah karena tingginya pemanasan dari penguapan air, ketika bekerja dengan ekstrak berair, penghilangan garam menjadi tahap yang sangat penting dan paling sulit. Tidak ada pula standar fraksinasi untuk mengisolasi komponen larut air sehingga hanya digunakan pendekatan trial dan error. Kromatografi penukar ion, kolom fase terbalik, HPLC pada bahan berpori, kombinasi kromatografi penukar ion dan size exclusion merupakan teknik yang efektif untuk pemisahan senyawa

BAB III
PENUTUP

Tidak ada teknik khusus yang dapat diikuti untuk pemisahan komponen dari campuran kompleks yang terdapat dalam ekstrak methanol/etanol dari organisme laut ketika sifat kimia dari senyawabioaktif tidak diketahui. Meskipun begitu, secara umum dengan fraksinasi menggunakan pelarut organik. Jika pemisahan efektif, aktifitas biologikal dapat diperoleh padakonsentrat tertentu. Terdapatnya garam yang melimpah dari air laut dapat ikut dapat ekstraksi sehingga pemisahan komponen larut airnya menjadi membingungkan. Konsentrasi ekstrak air juga menghasilkan masalah karena tingginya pemanasan dari penguapan air, ketika bekerja dengan ekstrak berair, penghilangan garam menjadi tahap yang sangat penting dan paling sulit. Tidak ada pula standar fraksinasi untuk mengisolasi komponen larut air sehingga hanya digunakan pendekatan trial dan error. Kromatografi penukar ion, kolom fase terbalik, HPLC pada bahan berpori, kombinasi kromatografi penukar ion dan size exclusion merupakan teknik yang efektif untuk pemisahan senyawa.
 

DAFTAR PUSTAKA

send request to my email : kxiehardi@gmail.com or leave a comment...... ^_^